Antecedentes y justificación. Los nanotubos de carbono (NTC) son materiales desarrollados por la nanotecnología. Los NTC tienen la característica de poder adquirir y transmitir señales bioeléctricas debido a sus dimensiones nanométricas, a su alta capacidad de conducción eléctrica y a su capacidad de adherirse a las membranas celulares. Se han usado distintos nanotubos de carbono de pared simple (NTCPS) y nanotubos de carbono de pared múltiple (NTCPM) como andamios o “scafolds” para cultivo de células nerviosas y se han reportado resultados controversiales en cuanto a su toxicidad, biocompatibilidad celular y crecimiento neuronal. No está claro si los NTC tienen un efecto bloqueante sobre los canales iónicos que subyacen a las señales bioeléctricas neuronales, tales como potenciales de acción y potenciales sinápticos. En particular no se ha demostrado ni evaluado la posible toxicidad de los NTCPM sobre los canales iónicos dependientes de voltaje (canales de calcio y canales de potasio) ni sobre los canales iónicos dependientes de agonista (canales acoplados al receptor de L-glutamato, acetilcolina y dopamina). Más aún, no se ha demostrado si los NTCPM pueden conectar eléctricamente a dos o más neuronas entre sí. i-2) Objetivos. a). Estudiar las propiedades ultraestructurales de los NTCPM dispersos en soluciones acuosas y depositados sobre distintos materiales incluyendo los depositados sobre las neuronas del ganglio del caracol de jardín Helix aspersa. b). Estudiar las propiedades eléctricas de los NTCPM depositados sobre distintos materiales. c). Estudiar los posibles efectos citotóxicos de los NTCPM sobre las señales eléctricas de las neuronas del caracol de jardin Helix aspersa . Específicamente, estudiar si los NTCPM bloquean o modifican la permeabilidad de canales iónicos dependientes del voltaje (canal de calcio y canal de potasio que dependen del calcio) y su efecto sobre canales iónicos dependientes de agonista químico o neurotransmisores (acetilcolina, dopamina y L-glutamato), que subyacen a los potenciales de acción y a los potenciales sinápticos de las neuronas de Helix aspersa . 6 i-3) Material y métodos. Nanotubos de carbono de pared múltiple (NTCPM) usados en este proyecto. Los NTCPM fueron sintetizados por el método de pirólisis de aspersión y fueron funcionalizados con soluciones ácidas de ácido nítrico - ácido sulfúrico; fueron dispersados en soluciones acuosas: agua desionizada y solución Ringer de caracol, usando polivinilpirrolidona (PVP) como agente dispersante. Los NTCPM ya dispersados en PVP fueron sometidos a ultrasonido y con ello se aseguró la homogeneidad de la dispersión. Propiedades ultraestructurales de NTCPM. Los NTCPM dispersados en soluciones acuosas fueron colocados sobre distintos materiales: papel bond, vidrio, filtros de PVDF y láminas de cobre. También los NTCPM se depositaron sobre las neuronas de Helix aspersa . Sus propiedades morfológicas y ultraestructurales se caracterizaron mediante el uso de diversos estudios: microscopía óptica, microscopía electrónica de barrido, microscopía electrónica de transmisión, microscopía confocal y microscopía de fuerza atómica. Preparación biológica. Las neuronas identificadas del invertebrado caracol de jardín H e lix a s p e r s a fueron utilizadas como modelo biológico en este trabajo de tesis. Estas neuronas presentan propiedades bioeléctricas y canales iónicos similares a los que existen en neuronas de mamífero, por lo que estas neuronas de invertebrado han sido utilizadas como modelos biológicos en múltiples estudios en el campo de la investigación básica en neurociencias. Las neuronas del caracol Helix aspersa son fácilmente identificables, tanto morfológica como electrofisiológicamente; presentan actividad eléctrica espontánea y su membrana celular posee canales iónicos de K+ y Ca2+, así como canales iónicos acoplados a receptores membranales como dopamina, L-glutamato y acetilcolina. Experimentos electrofisiológicos de registro intracelular. En el desarrollo experimental de este proyecto se utilizaron técnicas electrofisiológicas convencionales de registro intracelular con microelectrodos en el modo de fijación de corriente. En estos experimentos se monitorearon señales bioeléctricas neuronales tales como: i). Potencial de membrana, ii). Actividad eléctrica espontánea, iii). Hiperpolarización postetánica, iv). Potencial de acción cálcico, v). Despolarización membranal activada por glutamato y carbacol y vi). Hiperpolarización membranal activada por dopamina. i-4) Resultados experimentales. a). Se estudiaron distintos compuestos para lograr una dispersión adecuada de los NTCPM en soluciones acuosas. Entre los diferentes compuestos ensayados se encontró que dimetilformamida es un buen dispersante, pero es tóxico para las células. Pluronic F-127 no era tóxico para las células, pero no se dispersaban eficientemente los NTCPM. La Polivinilpirrolidona (PVP) fue el mejor dispersante encontrado para NTCPM y no tiene ningún efecto tóxico en las neuronas y células estudiadas. Se demostró que la manipulación mecánica por sonicación de NTCPM, así como el uso de dispersantes biocompatibles, mejoran la dispersión de NTCPM en soluciones acuosas. b). Mediante el uso de estudios de microscopía óptica, microscopía electrónica de barrido, microscopía electrónica de transmisión, microscopía confocal y microscopía de fuerza atómica, se caracterizaron las propiedades ultraestructurales de los NTCPM depositados en distintos materiales: papel bond, vidrio, filtros de fluoruro de polivinilideno (PVDF) y laminas de cobre; así como los aplicados sobre las neuronas de Helix aspersa . c). En este trabajo de tesis se encontró que los electrodos hechos con NTCPM y depositados sobre papel bond y filtros de PVDF tienen una menor resistencia; por consiguiente una mejor conductividad en comparación con otros materiales electroconductores, tales como la plata y la pintura de grafeno. Se realizaron estudios de microscopía de fuerza atómica (AFM) y estudios de microscopía electrónica de barrido (SEM) con el fin de caracterizar las propiedades ultraestructurales y de distribución de NTCPM en filtros de PVDF. Se observó que los electrodos hechos con NTCPM colocados sobre filtros de PVDF tienen una distribución topográfica caótica y éstos no están alineados; sin embargo, los NTCPM depositados sobre los filtros de PVDF mostraron una resistencia eléctrica lineal sin rectificación. Además se demostró que los electrodos de NTCPM pueden utilizarse para el registro y detección de señales bioeléctricas, ya que dichos electrodos fueron capaces de registrar señales electrocardiográficas en humanos con resolución y eficiencia similar a los registrados con electrodos convencionales de plata. d). En otra serie de experimentos se obtuvieron resultados que demuestran que los NTCPM son sensibles a la irradiación del láser y que este estímulo reduce sistemáticamente su resistencia eléctrica intrínseca. La resistencia eléctrica de los NTCPM se midió en condiciones de control y cuando se les aplicó un haz de láser 8 continuo cercano al infrarrojo (nIR-láser) a una longitud de onda de 650 nm. Se encontró que los NTCPM mostraron un valor constante de la resistencia eléctrica y dicho valor de resistencia fue dependiente de la cantidad de nanotubos aplicada sobre los filtros de PVDF. La resistencia media de los NTCPM sobre filtros de PVDF fue como sigue (en ohms): 23, 307 y 2275 en diluciones 1, 1:10 y 1:100 de la solución madre de NTCPM (5 mg/mL) respectivamente. Se demostró que nIR-láser disminuyó la resistencia eléctrica en forma transitoria, ya que al suspender la irradiación láser dicho valor de resistencia se recuperó a valores normales. Además se observó un pequeño aumento de la temperatura (1.2 a 3.2 °C) durante la irradiación con láser. Los resultados aquí presentados apoyan la hipótesis de que la irradiación láser modula, con una alta sensibilidad, las propiedades eléctricas y térmicas intrínsecas de los NTCPM. e). Existen reportes controversiales respecto a la toxicidad de los NTC en las células neuronales y su posible efecto de bloqueo de permeabilidad de canales iónicos presentes en neuronas y otras células excitables. En este trabajo de tesis se evaluó el posible efecto bloqueante de NTCPM sobre las permeabilidades iónicas dependientes de voltaje de las neuronas de Helix aspersa . Se realizaron estudios de microscopía óptica, electrónica de barrido y microscopía confocal para demostrar que los NTCPM aplicados sobre las neuronas están dispersados adecuadamente; pueden adherirse a las membranas neuronales y eventualmente podrían bloquear las permeabilidades de canales iónicos localizados en la membrana celular. En experimentos iniciales, los NTCPM fueron marcados con isotiaocianato de fluoresceína (FITC) y con técnicas de microscopía confocal, y se estudió la posible interacción de estos nanotubos fluorescentes con la membrana celular de neuronas del caracol Helix aspersa . En otra serie de experimentos se analizaron neuronas íntegras y cortes histológicos de neuronas del ganglio de Helix aspersa con técnicas de microscopía óptica y microscopía electrónica de barrido, así como microscopía confocal, en donde las neuronas fueron tratadas con NTCPM sin marcaje con fluoresceína. Se pudo demostrar que los NTCPM se adhieren a la membrana celular, atraviesan dicha membrana y tienden a acumularse al interior del citoplasma y sobre el núcleo. f). Habiendo demostrado que los NTCPM se adhieren a la membrana celular y pueden atravesar dicha membrana, se realizaron experimentos de registro intracelular en la configuración de fijación de corriente con el propósito de evaluar el posible efecto de NTCPM sobre: i). La amplitud y la duración del potencial de acción normal, ii). La hiperpolarización postetánica y iii). La duración del potencial de acción de calcio (PA-Ca 2+) en las neuronas de Helix aspersa . En estos experimentos se encontró que los NTCPM no bloquearon ni modificaron la amplitud ni la mofología de los potenciales de acción normales y potenciales de acción cálcicos; tampoco modificaron la hiperpolarización postetánica. Por lo anterior se puede inferir que los NTCPM no bloquean los canales de sodio, ni de potasio, ni de calcio dependientes de voltaje presentes en la membrana neuronal de las neuronas de Helix aspersa . g). En otra serie de experimentos se estudiaron los posibles efectos tóxicos de los NTCPM sobre la permeabilidad iónica de los canales ionicos activados por agonistas y neurotransmisores. La técnica convencional de registro intracelular en el modo de fijación de corriente fue la utilizada para evaluar las propiedades electrofisiológicas de los canales ionicos activados por dopamina, L- glutamato y carbacol en la neurona 1F. En estos experimentos electrofisiológicos se caracterizaron la presencia de estos receptores membranales en las neuronas de Helix aspersa , así como sus propiedades farmacológicas. Se encontró que el receptor colinérgico en neurona 1F es de tipo muscarínico M1-M3, ya que la despolarización membranal activada por carbacol es inhibida por atropina y pirenzepina y es incrementada con oxotremorina. En el caso de la hiperpolarización activada por dopamina se encontró que dicha hiperpolarización es regulada por receptores dopaminérgicos tipo D2, ya que los fármacos metoclopramida y ergometrina (antagonistas específicos de los receptores dopaminérgicos D2) bloquean la respuesta de la dopamina. En el caso de la respuesta glutamatérgica se encontró que la despolarización activada por glutamato es moderadamente sensible a bloqueadores tipo ampa-kainato. Se encontró que esta respuesta muscarínica, glutamatérgica y dopaminérgica de la neurona 1F no es bloqueada por los NTCPM a concentraciones de hasta 0.5 mg/mL. De esta serie de experimentos se concluye que los NTCPM no bloquean los canales iónicos dependientes de agonistas. 10 h). Se evaluaron los efectos de NTCPM en otras preparaciones biológicas (células de protistas y de mamíferos) con el propósito de corroborar la no toxicidad y la biocompatibilidad de los NTCPM usados en este trabajo de tesis. Se encontró que los NTCPM son incorporados al interior del citoplasma del Paramecium; no por simple difusión, sino por un proceso membranal de endocitosis. Estos nanotubos no modificaron la sobrevida ni el nado normal del Paramecium; sin embargo, a altas concentraciones de NTCPM, de más de 200 µg/mL, se modificó la conducta de galvanotaxis del ciliado. En otra serie de experimentos se estudió el posible efecto citotóxico de NTCPM en neuronas del hipocampo de mamífero. En dichos experimentos, se encontró que las neuronas de hipocampo de rata cultivadas y depositadas sobre un andamio o “scaffold” hecho con los NTCPM presentaron propiedades electrofisiológicas similares a las neuronas cultivadas sobre cubreobjetos de vidrio sin NTCPM. Se observó que la transmisión sináptica entre pares de neuronas no fue inhibida; más aún, dicha actividad sináptica se vio incrementada. i-5) Conclusiones y perspectivas. En los experimentos realizados para este trabajo de tesis, se logró una dispersión eficiente de NTCPM en soluciones acuosas. Los NTCPM tienen las siguientes características: i). Presentan una baja resistencia eléctrica y consecuentemente una alta conductividad, ii). No tienen un efecto deletéreo o tóxico sobre las propiedades eléctricas de las neuronas de caracol, iii). No bloquean los canales iónicos dependientes de voltaje, y iv). No bloquean los canales iónicos dependientes de agonista. Se demostró que los NTCPM se pueden usar como electrodos de registro para sensar y registrar señales bioeléctricas, tales como el electrocardiograma en humanos. Además se demostró que la resistencia intrínseca de los NTCPM se disminuye al exponer dichos NTCPM a la irradiación láser cercano al infrarrojo. Sin embargo, queda aún pendiente el demostrar que los NTCPM incorporados a electrodos de registro puedan registrar la actividad eléctrica neuronal. También será necesario estudiar si los NTCPM pueden conectar eléctricamente a dos o más neuronas entre sí. Considerando la alta sensibilidad de los NTCPM al láser, estos materiales podrán ser usados en futuros experimentos como alternativa terapéutica para el cáncer, al aplicarse dichos NTCPM en procesos tumorales para lograr ablación tumoral usando el método de hipertermia inducida por láser en tumores cancerosos.
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