Contribución al estudio de las actividades enzimáticas involucradas en el mecanismo de patogenicidad de Lecanicillium (Verticillium) lecanii cultivado en medio sólido Pubblico Deposited
En la agricultura sustentable, el control biológico se ha convertido en una parte fundamental para el manejo de plagas. Los hongos entomopatógenos, entre ellos Lecanicillium (Verticillium) lecanii, se han utilizado para la producción de bioinsecticidas para el control de plagas. Este trabajo contribuye al estudio de L. lecanii (hongo entomopatógeno) cultivado en medio sólido y su relación con las enzimas que están involucradas en la degradación de la cutícula del insecto. Se ha demostrado que el cultivo sólido presenta características microambientales similares a las que se presentan en el proceso de infección natural de los hongos entomopatógenos. Por lo que el cultivo sólido se ha convertido en un área potencial para el estudio de hongos entomopatógenos. En el sistema-modelo se propuso la utilización de cutícula de Sphenarium purpurascens como inductor de las enzimas degradadoras de la cutícula en un medio mineral impregnado en bagazo de caña. En el presente estudio se evaluaron 3 criterios para la selección de cepas para su cultivo en medio sólido: a) Crecimiento a una baja actividad de agua (aW), b) Tasa de producción de CO2, como medida indirecta del crecimiento, c) Actividades enzimáticas relacionadas con la degradación de la cutícula. La medición en línea del CO2 producido es un parámetro adecuado para llevar a cabo el seguimiento de la fermentación sólida, mientras que las actividades enzimáticas permitirían determinar la virulencia de la cepa. Una vez seleccionada la cepa de L. lecanni ATCC 26854, se estudió la cinética de producción de CO2 y de las actividades enzimáticas bajo distintas condiciones de cultivo iniciales. Se ensayaron diferentes sustratos a dos valores de pH inicial (4 y 6): sacarosa (1 %), un sustrato complejo (cutícula 6 %) y una mezcla de cutícula (6 %) con sacarosa (1 %). La forma del perfil de la producción de CO2 depende del tipo de sustrato, en el caso del sustrato complejo (cutícula) se obtiene una banda ancha, mientras que con la presencia de sacarosa la tasa de formación de CO2 es muy rápida y da lugar a la formación de un pico pronunciado. Al emplear sacarosa y cutícula simultáneamente, la producción de las proteasas y quitinasas es posterior al pico de consumo rápido de azúcar. Las quitinasas tienen su mayor nivel de expresión a un pH inicial de 4.0. Los niveles de expresión de las proteasas no son dependientes del pH. La producción total de CO2 fue mayor a pH 6 que a pH 4 por lo que sugiere que esta condición es más favorable para el crecimiento. Las imágenes de microscopía electrónica mostraron la adhesión y formación del apresorio sobre la superficie de la cutícula y su crecimiento sobre el sustrato complejo. Las actividades enzimáticas de proteasas y quitinasas fueron parcialmente caracterizadas, en función del pH y de la temperatura. Las quitinasas presentaron su mayor actividad a pH 5.0 y las proteasas a pH 8.0. Respecto al efecto de la temperatura, las proteasas fueron más termoestables que las quitinasas. Las energías de activación fueron calculadas por la ecuación de Arrhenius y correspondieron al intervalo de valores típicos en sistemas biológicos. En su conjunto el sistema de cultivo propuesto contribuye al entendimiento de la fisiología del cultivo de L. lecanii en medio sólido y su relación con las enzimas degradadoras de la cutícula. Este trabajo demuestra la factibilidad técnica del cultivo sólido para ser utilizado en la producción de bioinsecticidas de hongos entomopatógenos, utilizando las esporas como partículas infectivas. Asimismo, se abre un área de investigación interesante para el diseño y desarrollo de nuevos bioinsecticidas.
Biological control in pest management is a fundamental part of sustained agriculture. Entomopathogenic fungi as L. lecanii have been used for bio-insecticide production in pest control. This work contributes to the study of L. lecanii (entomopathogenic fungus) in a solid substrate culture and its relationship with the enzymes involved in insect cuticle degradation. Solid substrate fermentation (SSF) presents some advantages to the traditional submerged fermentation approach, since it is similar to the natural process of insect infection by fungi, therefore this system can lead us to a better understanding of entomopathogenic fungic processes. In this study, 3 criteria for selection strains in solid culture were evaluated: a) Growth at low water activity (aw), b) CO2 production rate, and c) Titres of enzymes involved in host invasion, such as chitinase and protease activities. CO2 on-line determination allowed monitoring of SSF process, while enzyme activities allowed to asses the virulence of microorganism. The strain L. lecanni ATCC 26854 was selected for further studies of CO2 production and enzymatics activities. Different substrates were evaluated at initial pH 4 and 6: sucrose (1 %), a complex substrate (cuticle 6 %) and a mixture of cuticle (6 %) with sucrose (1 %). CO2 production rate was dependent on carbon source, a rapid consumption of sucrose cause a rapid response of CO2 production rate, in contrast in the presence of cuticle the CO2 production rate showed a bell shape curve. When a mixture of substrates was used a mixed behavior was observed. Productions of protease and chitinase were higher in medium containing sucrose and cuticle medium and were observed after consumption of sucrose. In contrast, protease and chitinase activities appeared early in fermentation, in the presence of cuticle. Chitinase showed its highest level of activity at pH 4. Protease activities were independent of pH and were delayed in the presence of sucrose. In extract crude, chitinase and protease enzimatic activities were partially characteryzed. Highest chitinase and protease activities were found at pH 5 and pH 8, respectively. Thermostability of protease enzymes was higher than chitinase. Activation energy values calculated by Arrhenius equation corresponded to the typical values enzymes biological systems. Scanning electronic microscope images showed the formation and adhesion of an appressoium over the cuticle surface and growth on the complex substrate. In conclusion, this investigation contributes to a better unterstanding of the phisiology of L. lecanii and cuticle degrading enzyme production. This research demonstrated the feasibility of solid culture for the production of biopesticides by entomopathogenic fungi, using spores as infective particles. Besides, it opens an interesting research area for the design and development of new biopesticides.
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