El objetivo de este trabajo fue determinar la acción de proteasas exógenas de Pseudomonas spp. sobre proteínas contráctiles de res en un sistema modelo, así como determinar la variedad de proteasas y pesos moleculares de los extractos enzimáticos obtenidos de las cepas probadas. En una primera etapa se hizo una selección de cepas proteolíticas mediante pruebas en placas de grenetina y caseina, se probaron 4 cepas aisladas de carne de res y se incluyeron P. fiagi (ATCC-4973) y P. fluorescens (NRRL-B-1244) por estar bien reportada su capacidad hidrolítica. De las 4 cepas aisladas, se seleccionaron la C61 y la C20 por presentar gran capacidad hidrolítica. Para la producción de proteasas, se propagaron todas las cepas en medio tripticaseina y soja (TSB) y posteriormente se inocularon en matraces bafleados de TSB con 1 m1 (1% v/v) de inóculo. Se eliminó la fracción celular por centrifugación y el sobrenadante se filtró para obtener un licor. Este filtrado se sometió a una precipitación fraccionaria con (NH,)$O, para insolubilizar las proteasas seguido de una resuspensión del precipitado, finalmente se dializó por 24 h. A los diferentes extractos enzimáticos se les determinó la actividad proteolítica utilizando caseina como sustrato. Para determinar la composición (diversidad) y pesos moleculares de las proteasas de los diferentes extractos enzimáticos, se llevó a cabo electroforesis en condiciones no desnaturalizantes en geles de poliacrilamida-SDS, estos geles fueron sumergidos en una solución de caseina por un tiempo predeterminado. Los geles fueron fijados, teñidos, y revelados para obtener las zonas bioactivas. El peso molecular se determinó mediante una curva patrón. La acción de las proteasas se probó sobre 3 fracciones miofibrilares: a) actomiosina (AM), b) miosina, actina y proteínas reguladoras, y c) actina. Para la extracción de las proteínas se utilizaron cortes de Biceps femoris y Semimembranoso comprado en un mercado local. La carne se homogenizó hasta obtener una pasta, se tomaron porciones iguales para la extracción de las fracciones miofibrilares. La fracción de AM se obtuvo mediante extracción con una solución salina de alta fuerza iónica, la fracción de miosina, actina y proteínas reguladoras se obtuvo mediante una solución de alta fuerza iónica y pirofosfatos, y por último la extración de actina se llevó a cabo en dos etapas, primero se obtuvo un polvo muscular mediante lavados con acetona y posteriormente se extrajo la actina con soluciones de baja fuerza iónica. La acción de las proteasas sobre las diferentes fracciones miofibrilares se realizó en alicuotas de 1 m1 en tubos de policarbonato hasta 48 h a 13OC, se tomaron muestras a los O, 4, 8, 12, 24, 36 y 48 h. A las muestras se les dió un pretratamiento desnaturalizante para someterlas a electroforesis en geles de poliacrilamida-SDS al 12%; los geles se fijaron, tiñeron, y revelaron para posteriormente leerlos por densitometría y calcular el peso molecular de las diferentes bandas. Paralelamente, para la acción proteolítica de estos extractos enzimáticos sobre proteínas miofibrilares de alto peso molecular (> de 200 KDa) se llevó a cabo una cinética sobre AM bajo las mismas condiciones; para obtener los perfiles electroforéticos de hidrólisis se emplearon geles de poliacrilamida-SDS al 3.5%.
5203 |a En los perfiles electroforéticos para la muestra de actomiosina, se mostró una gran degradación de todas las proteínas por parte de los cuatro extractos enzimáticos, siendo el obtenido por la cepa C61 el que presentó la mayor degradación de la banda de miosina pesada (P>O.OOOl). En cuanto a la muestra de miosina, actina y proteínas reguladoras, el comportamiento fue similar al que se observó en la preparación de actomiosina, teniéndose una mayor degradación de miosina pesada por los extractos de C61 y P. Pugi (P>O.OOOl). Con respecto a la acción sobre la preparación de actina, la degradación de ésta fue evidente sin encontrar diferencia significativa entre la acción de las proteasas. En las proteínas de alto peso molecular se observó degradación de titina, nebulina y filamina por parte de extractos de C6 1, P. Jiugi y P. fluorescens. Se encontró que P. Pagi produjo 2 proteasas, una de 49.2 KDa y otra de 34.2 KDa, P. Jluorescens una de 46.1 KDa, en cuanto a las cepas aisladas de carne la cepa C61 mostró una proteasa muy activa de 46.8 KDa y por último la cepa C20 una proteasa de 49.2 KDa.
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