Efecto de las secreciones oviductales y uterinas sobre el desarrollo in vitro de embriones clones de ovis aries 上市 Deposited
Introducción: La transferencia nuclear de células somáticas (TNCS) es una biotecnología con aplicación en diferentes áreas tales, como la replicación de animales de interés zootécnico, especies silvestres amenazadas y animales transgénicos. No obstante, la TNCS no ha tenido la aplicación práctica como otras biotecnologías reproductivas, debido a factores intrínsecos de la propia técnica, tales como resistencia a la reprogramación de la célula somática, pobre potencial de reprogramación de los ovocitos, traumatismo por manipulación y condiciones subóptimas del cultivo embrionario in vitro. Por otra parte, se ha reportado que la adición de fluido oviductal (FO) y uterino (FU) en el medio de cultivo in vitro de embriones generados por FIV en diferentes especies domésticas, tiene un efecto positivo en el desarrollo y la calidad embrionaria; debido a que el FO y el FU contienen una amplia variedad de proteínas que cumplen diferentes funciones durante el desarrollo embrionario y de las cuales carecen los medios de desarrollo embrionario in vitro. El objetivo del presente estudio fue evaluar el volumen, la osmolaridad, la concentración y el patrón de distribución de las proteínas del FO y FU, e identificar las proteínas OVGP1, HSP70 y Ezrin que son importantes para la fisiología reproductiva. Una vez que se evaluaron dichas propiedades, se analizó el efecto del FO y FU en el desarrollo de embriones clones y partenogenéticos de Ovis aries, así como en el balance de especies reactivas de oxígeno (ERO) y glutatión (GSH). Resultados: Se obtuvo en promedio de 3.2±1.5 µL de FO y 17±0.5 µL de FU por aparato reproductor; la osmolaridad fue de 343 ± 20.8 mOsm kg-1 y 280 ± 96.2 mOsm kg-1 y la concentración de proteínas fue de 71.9 ± 23.8 g L-1 y 21.8 ± 1.1 g L-1 , respectivamente. En el patrón de distribución de proteínas se observaron 20 bandas en FO y 14 bandas en FU. De ellos, 14 y 8 fueron específicos de FO y FU y 6 comunes a ambas. El espectro de pesos moleculares de las proteínas fue de 24 a 324 y de 29 a 353 kDa para FO y FU. Se identificó la presencia de las proteínas OVPG1, HSP70 y Ezrin en ambos fluidos, encontrándose en mayor cantidad en el FO. No se observó efecto en el desarrollo de embriones partenogenéticos y clones con 0.5% de FO y FU. Sin embargo, al 1 y 2% de FO y FU, se observó un efecto negativo en las primeras divisiones en los embriones partenogenéticos y en la etapa de blastocisto para los embriones clones. Se observó una disminución de los niveles intracelulares de ERO y GSH en los blastocistos partenogenéticos tratados con 1.0% de FO y FU, mientras que no se observó efecto alguno en los embriones clones. Sin embargo, los embriones clones presentaron mayor concentración de GSH que los embriones partenogenéticos. Conclusiones: El volumen recuperado de FU fue 5 veces mayor que el de FO. Tanto la osmolaridad como la concentración de proteínas fueron mayores en FO que en FU (1.2 y 3 veces mayores). El patrón de distribución de proteínas entre FO y FU fue diferente, siendo más complejo en FU. Las proteínas OVGP1, HSP70 y Ezrin fueron identificadas en el FO y FU, encontrándose en mayor cantidad en el FO. No se observó efecto de los FO y FU sobre el desarrollo embrionario y el balance redox en los embriones clones de ovino generados por clonación manual.
Introduction: Somatic cell nuclear transfer (SCNT) is a biotechnology with different application fields such as replication of zootechnical interest animals, endangered wildlife and transgenic animals. However, SCNT has not had the practical application like other reproductive biotechnologies, due to intrinsic factors of the technique itself, such as resistance to somatic cell reprogramming, oocytes with poor reprogramming potential, handling trauma and suboptimal conditions of embryonic culture in vitro. Moreover, it has been reported that supplementing oviductal fluid (OF) and uterine fluid (UF) during in vitro culture of IVF embryos in different domestic species has a positive effect on embryo development and quality; because OF and UF contain a wide variety of proteins which perform different functions during embryonic development and which are lacking in vitro culture medium for embryo development. The aim of this study was to evaluate the volume, osmolarity, concentration and proteins distribution pattern of OF and UF, identify the proteins OVGP1, HSP70 and Ezrin which are important for reproductive physiology. Once these properties were evaluated, the effect of OF and UF on the development of clone and parthenogenetic embryos of Ovis aries was analyzed, as well as the balance of reactive oxygen species (ROS) and glutathione (GSH). Results: An average of 3.2±1.5 µL of OF and 17±0.5 µL of UF per reproductive system was obtained; osmolarity was 343±20.8 mOsm kg-1 and 280±96.2 mOsm kg-1 and protein concentration was 71.9±23.8 g L-1 and 21.8±1.1 g L-1 , respectively. The protein distribution pattern, 20 bands in OF and 14 bands in UF were observed. Of these, 14 and 8 were specific to OF and UF and 6 were common to both. The molecular weight spectrum of proteins was 24 to 324 and 29 to 353 kDa for OF and UF. The presence of the proteins OVPG1, HSP70 and Ezrin in both fluids was identified, being in greater quantity in the OF. No effect was observed in the development of parthenogenetic embryos and clones with 0.5% OF and UF. However, at 1 and 2% of OF and UF, a negative effect was observed in the first divisions in parthenogenetic embryos and in the blastocyst stage for clone embryos. A decrease in intracellular levels of ROS and GSH was observed in parthenogenetic blastocysts treated with 1.0% OF and UF, while no effect was observed in clone embryos. However, clone embryos had higher concentrations of GSH than parthenogenetic embryos. Conclusions: The volume of UF recovered was 5 times greater than OF. Both osmolarity and protein concentration were higher in OF than in UF (1.2 and 3 times higher). The protein distribution pattern between OF and UF was different, being more complex in UF. The proteins OVGP1, HSP70 and Ezrin were identified in the OF and UF, being in greater quantity in the OF. No effect was observed of OF and UF on embryonic development and redox balance on sheep clone embryos by Handmade Cloning.
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