Estudio cinético termodinámico de la interacción intermolecular de antocianinas con goma de mezquite y sus fracciones Pubblico Deposited
Mesquite gum is a highly branched polysaccharide that has demonstrated a great similarity with Arabic gum and even it has shown better functional properties than the latter. In this work it was found that mesquite gum is composed by three principal fractions with different molecular weights and chemical compositions, getting a rich polysaccharide fraction (F1) and two more fractions (F2 and F3) with higher protein content than that determined for the whole mesquite gum. Molecular weight of these fractions ranged from 1.81 x 104 to 5.23 x 105 Da; being the smallest for the fraction with the highest protein content. These results are in accordance with the hydrodynamic diameter data for the biopolymer solutions, in which as higher the protein content, a shorter hydrodynamic diameter was obtained. Protein contents ranged from 0.76 to 46.21% in the following order F1 < GM < F2 < F3. The carbohydrate and amino acid profiles contents were done for each biopolymer. It was found that the highest contents of these both groups were the saccharide Arabinose and the amino acids Proline and Hydroxyproline respectively. On the other hand, through the isolations and purification of the anthocyanins extracted from Roselle calyces, it was found that the raw extract displayed a concentration of total monomeric anthocyanins of 28.52 mg/gsolids using the cyainidin-3- glucoside as standard with a molar extinction coefficient ε=26, 900 cm-1mol-1, a characteristic absorbance between 490-550 nm and a molecular weight of 449.2g/mol. Also it was found that this extract showed an antioxidant activity equivalent to Trolox of 0.59 mM, which corresponds to an inhibition of 44.7% of the ABTS* radical. Chromatographic assays shown that Roselle raw extract is composed by two main anthocyanins: glycosilates of cyanindin and delphinidin. Nevertheless, because this work focuses to the anthocyanins – protein rich fraction biopolymers interaction, in order to avoid interferences, it was decided to work only with one anthocyanins. In the antocyanin isolation process, six fractions with different concentrations of both anthocyanins were obtained, and even when in all the fraction the presence of both anthocyanins remained, fraction F5A was chosen as the anthocyanin fraction rich in delphinidin with more than 90% respect the second one. Not only the mesquite gum fractions but also the whole mesquite gum, were subjected to an electrostatic interaction with the isolated anthocyanins, for these compounds the pH, ratio and concentration conditions were determined in order to establish the interaction window in function of pH to find the minimum stoichiometric electrostatic charge difference, and under these conditions the kinetic and thermodynamic properties were carried out. In these interaction assays, the main amino acids found in the biopolymers were used in order to determine if their residues in the backbone structure of the biopolymers are the responsible of such interactions, and by this way elucidate the possible interaction sites. Results from calorimetric studies displayed that some aminoacids shown high affinity for the anthocyanins, while some like glutamic acid and glycine did not provide a favorable result. In the same way, it can be seen that the stoichiometric parameter (n) when the biopolymers were used showed that the anthocyanins content required to interact with the protein fraction increases when the protein content increases, giving rise to ensure the existence of an interaction between flavonoids and protein fractions. So, it can be concluded that some exposed amino acid residues found in the whole mesquite gum and in its fractions take part in the complex formation. Nonetheless, the great molecular weight of these macromolecules represents an impairment for the interaction conditions optimization, resulting in a titanic labor the “exact” elucidation of which and haw many aminoacids participate in these reactions. Also it was found that the interfacial rheological characterization of these biopolymers did not display significant differences when the oil-water interfases in presence or absence of anthocyanins, this lead us to establish that the functional properties of the whole mesquite gum and its fractions remained constants. This led to conclude that it is possible to take advantage of the physicochemical properties of both chemical species to make them interact and to form stable intermolecular complexes, which are able to maintain their functional properties and in the case of mesquite gum fractions, to improve their properties respect to the whole gum. These results open the possibility to deepen this investigation, using other techniques for fractionation and isolation of the protein fraction in the biopolymers to a reasonable size so that techniques such as 1D and 2D NMR would be possible to determine the exact sites of binding and also assessing the functional properties of anthocyanins in the complex and its stability.
La goma de mezquite es un polisacárido altamente ramificado que ha demostrado poseer una gran semejanza con la goma Arábiga e incluso ha presentado mejores propiedades funcionales. En este trabajo se encontró que la goma de mezquite está compuesta por tres fracciones principales con pesos moleculares y composiciones químicas distintas, obteniendo una fracción rica en polisacáridos (F1) y dos fracciones con una concentración de proteína mayores al encontrado para la goma de mezquite sin fraccionar (F2 y F3). Los pesos moleculares de estas fracciones se encontraron entre 1.81 x 104 a 5.23 x 105 Da, siendo menor para la fracción con el mayor contenido de proteína. Estos resultados están en concordancia con los resultados obtenidos para el diámetro hidrodinámico de estos biopolímeros en solución, donde conforme el contenido de proteína aumenta, el diámetro hidrodinámico tiende a disminuir. Las concentraciones de proteína variaron de manera creciente desde un 0.76 hasta un 46.21% de acuerdo con el siguiente orden F1 < GM < F2 < F3. Se realizó el perfil de carbohidratos y aminoácidos para estos biopolímeros, encontrando que las mayores concentraciones de estos grupos bioquímicos fueron de Arabinosa y de Prolina e Hidroxiprolina, respectivamente. Por otra parte, se realizó el aislamiento y purificación de antocianinas a partir de cálices de flor de Jamaica (Hibiscus sabdariffa L.). Se encontró que el extracto crudo presentó una concentración de 28.52 mgantocianinas monoméricas totales/gsólidos utilizando la cianidina-3-glucósido como patrón con un coeficiente de extinción molar de ε=26, 900 cm-1mol-1, una absorbancia característica entre 490-550 nm y un peso molecular de 449.2 g/mol. Se encontró que este extracto presentó una actividad antioxidante de 0.59 mM equivalente a Trolox correspondiente a un 44.7% de inhibición del radical ABTS*. Las pruebas de cromatografía mostraron que este extracto se compone de dos principales antocianinas glicosiladas: cianidina y delfinidina. Sin embargo, para verificar la interacción de antocianinas con biopolímeros que contienen una fracción proteica se decidió trabajar únicamente con delfinidina. Durante su proceso de aislamiento se obtuvieron seis fracciones con diferentes concentraciones y proporciones de las dos antocianinas registradas en el extracto crudo, y aunque en todas las fracciones ambas antocianinas se encontraron presentes, se decidió trabajar con la fracción F5A, debido a que ésta presentaba el contenido de delfinidina con más del 90% de concentración respecto a la segunda antocianina. Tanto las fracciones de la goma de Mezquite como la goma sin fraccionar se sometieron a una interacción electrostática con la fracción F5A aislada de un extracto de flor de Jamaica. Se determinaron las condiciones de pH, proporciones y concentraciones adecuadas para llevar a cabo dicha interacción a través de la estimación de la ventana de interacción de pH contra potencial zeta, en los cuales tanto los biopolímeros como las antocianinas presentaban la mínima diferencia estequiométrica de sus cargas. Bajo estas condiciones se estudiaron las propiedades cinéticas y termodinámicas de dicha interacción utilizando la técnica de calorimetría isotérmica de titulación. Estas pruebas también se realizaron utilizando los principales aminoácidos presentes en los biopolímeros con la finalidad de verificar si estos son los responsables de las interacciones electrostáticas, y de esta manera elucidar los posibles sitios de interacción existentes entre ambas especies químicas. Los resultados encontrados a partir de la calorimetría mostraron que algunos aminoácidos, que se encontraron en mayor cantidad en los biopolímeros, presentaron alta afinidad por las antocianinas, mientras que algunos otros como el ácido glutámico y la glicina no resultaron favorecidos por dicha interacción. De igual forma puede observarse que el parámetro estequiométrico (n) de este análisis para los biopolímeros muestra que la cantidad de antocianinas requeridas incrementa conforme la concentración de proteína también incrementa, dando pie a asegurar que sí existe interacción entre ambas especies químicas y que existe una relación con las interacciones entre antocianina-aminoácidos. Por tanto, puede decirse que los residuos expuestos de estos aminoácidos en las estructuras moleculares tanto de la goma de mezquite sin fraccionar como en sus fracciones sí tienen participación; sin embargo, el gran tamaño de estas macromoléculas representa un impedimento para optimizar las condiciones de interacción, resultando en una labor titánica la elucidación “exacta” de qué y cuántos residuos de aminoácidos interactúan. Por otra parte, se encontró que la caracterización reológica interfacial de estos biopolímeros no mostró diferencias significativas cuando las interfases aceite-agua están en presencia de antocianinas, lo cual nos permite decir que las propiedades funcionales de las fracciones de la goma de mezquite, así como de la goma sin fraccionar se mantuvieron constantes aún para los complejos con antocianinas. Lo anterior llevó a concluir que es posible aprovechar las propiedades fisicoquímicas de ambas especies (GM y antocianinas) para hacerlas interaccionar y formar complejos intermoleculares estables, capaces de mantener sus propiedades funcionales. Estos resultados abren la posibilidad para profundizar en dicha investigación, utilizando otro tipo de técnicas de fraccionamiento y aislamiento de la fracción proteica de cada una de las fracciones hasta un tamaño razonable, de manera que por técnicas como RMN en 1D y 2D sea posible determinar los sitios exactos de unión así como poder evaluar las propiedades funcionales de las antocianinas en el complejo y su estabilidad.
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