En el presente proyecto de tesis doctoral se estudió el efecto antifúngico de soluciones y películas de quitosano sobre el crecimiento de hongos filamentosos como Aspergillus niger y Penicillium chrysogenum. En este documento se muestra información acerca de la importancia del quitosano como polímero natural, así como también de sus fuentes de obtención, características, aplicaciones y propiedades antimicrobianas (Capítulo 2). Los resultados obtenidos se presentarán en las siguientes etapas fundamentales: 1. Efecto inhibitorio del quitosano sobre el crecimiento apical y la germinación de esporas de Aspergillus niger, utilizando medio de cultivo sólido Czapeck (Capítulos 8.1 y 8.2). 2. Efecto inhibitorio del quitosano (CQ50) sobre la polarización y germinación de esporas de Aspergillus niger, utilizando medio de cultivo líquido Czapeck (Capítulo 8.3). 3. Elaboración y caracterización de películas de quitosano (Capítulo 8.4 y 8.5). 4. Evaluación antifúngica de películas de quitosano sobre el crecimiento de Aspergillus niger y Penicillium chrysogenum (Capítulo 8.5.5). Etapa 1. Efecto inhibitorio del quitosano sobre el crecimiento apical y la germinación de esporas de Aspergillus niger, utilizando medio de cultivo sólido Czapeck. En esta etapa se realizaron diversos estudios para determinar el efecto antifúngico del biopolímero sobre la germinación de esporas y el crecimiento apical de Aspergillus niger mediante experimentos in vitro, a 30°C, en dónde se determinó la capacidad inhibitoria del quitosano sobre el crecimiento radial, diámetros y longitudes de las hifas y producción de biomasa. Asimismo se realizó un análisis de microscopía electrónica de barrido en ambas fases de crecimiento (germinación de esporas y crecimiento apical) (Capítulo 8.1).
Si bien es cierto que existen numerosos reportes relacionados con el estudio del efecto del quitosano sobre el crecimiento de hongos filamentosos, la mayoría describe el efecto del biopolímero sobre el crecimiento apical de diferentes tipos de hongos. No obstante, considerando que las alteraciones pueden ocurrir desde que el microorganismo se ha puesto en contacto con el alimento y de acuerdo a los resultados obtenidos, en este trabajo se realizaron experimentos posteriores sobre el estudio del efecto combinado del quitosano y temperatura de incubación (12, 17, 22, 25 y 37°C) sobre la germinación de esporas de A. niger (Capítulo 8.2). Las determinaciones realizadas fueron las siguientes: concentración inhibitoria media (CQ50), porcentaje de inhibición de la germinación, estimación de los parámetros de germinación (S, S0, Smax y k), cálculo de la energía de activación y efecto sinérgico entre el biopolímero y la temperatura. Todos los experimentos fueron realizados utilizando placas con agar Czapeck y los resultados obtenidos indicaron que la utilización quitosano a un nivel relativamente bajo (<3.5 g/L) es una alternativa viable al empleo de los compuestos químicos que se adicionan para inhibir el desarrollo de microorganismos en alimentos, obteniendo resultados significativamente mejores al combinar el biopolímero con temperaturas de refrigeración y atmósferas modificadas. Etapa 2. Efecto inhibitorio del quitosano (CQ50) sobre la polarización y germinación de esporas de Aspergillus niger, utilizando medio de cultivo líquido Czapeck. En la segunda etapa del trabajo se presentará un análisis acerca del efecto del quitosano sobre la polarización y germinación de esporas de Aspergillus niger (Capítulo 8.3.2), así como de los parámetros morfométricos (diámetros de las esporas y de las hifas), utilizando análisis de microscopía de imágenes (Capítulo 8.3.1). En un estudio más detallado se determinó la actividad antifúngica del biopolímero sobre el proceso de divisiones mitóticas de las esporas y la septación de las hifas de Aspergillus niger, utilizando microscopía de fluorescencia (Capítulos 8.3.3 y 8.3.4). Los resultados demostraron que el quitosano afecta el crecimiento de A. niger a nivel de división nuclear, alterando fuertemente el diámetro promedio de las hifas y el proceso de septación del hongo. Etapa 3. Elaboración y caracterización de las películas de quitosano. En esta etapa de la tesis se detallarán los estudios relacionados con la elaboración (Capítulo 8.4) y caracterización mecánica de las películas elaboradas a base de quitosano, ya sea solo o en combinación con otros materiales naturales (sorbitol, sacarosa) o sintéticos (polietileno de baja densidad), utilizando las técnicas de evaporación de solventes y extrusión, respectivamente (Capítulo 8.5). Las películas fueron caracterizadas en cuanto a sus propiedades mecánicas de esfuerzo-deformación, morfología (utilizando análisis de microscopía electrónica de barrido) y permeabilidad al oxígeno; de ésta última solo se discutirán los resultados de las películas obtenidas por la técnica de evaporación. Etapa 4. Evaluación antifúngica de películas de quitosano sobre el crecimiento de Aspergillus niger y Penicillium chrysogenum. En la última etapa del trabajo experimental se presentarán los resultados obtenidos al evaluar la actividad antifúngica de las películas de quitosano preparadas mediante evaporación de solventes (Capítulo 8.5.5). Para lo anterior se llevaron a cabo experimentos in vivo en dónde se prepararon empaques, los cuales se utilizaron para guardar piezas de queso manchego comercial inoculadas con esporas de Aspergillus niger (a 30°C); los parámetros evaluados fueron crecimiento radial y porcentaje de unidades experimentales contaminadas. Con base en los resultados obtenidos, se diseñó un experimento posterior en dónde se evaluó el efecto de las películas sobre el crecimiento de Penicillium chrysogenum, seleccionado en base a su mayor incidencia para desarrollarse en el producto alimenticio utilizado, con respecto a A. niger. La temperatura de incubación utilizada fue de <10°C (refrigeración), evaluando el porcentaje de unidades experimentales contaminadas, acidez e índice de rancidez. Al analizar los resultados se encontró que el estudio de las películas elaboradas a base de mezclas de quitosano con otros materiales, naturales o sintéticos, resulta ser un tópico de gran interés en la búsqueda de nuevos materiales que combinen las características antimicrobianas del primero y las propiedades flexibles de los últimos, para su aplicación como materiales de empaques para alimentos. Asimismo, el empleo del quitosano como biomaterial permitiría ofrecer una alternativa potencial al uso indiscriminado de materiales sintéticos, los cuales no son biodegradables y ocasionan graves problemas ambientales.
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