Morfología y fisiología de Bacillus thuringiensis Y₁₅ y EA₃ cultivados en concentraciones elevadas de glucosa: cultivo líquido vs cultivo sólido Público Deposited
Bacillus thuringiensis is a bacterium known worldwide for the ability to produce crystals with insecticidal characteristics, this property has been used for the elaboration of commercial formulations that have managed to position itself among the best sellers in the bioinsecticide market. In the last decade, solid medium culture has been explored as an alternative to produce B. thuringiensis, improving the yields of spores and crystals that this bacterium produces. Mainly agro-industrial waste has been used as a support and source of nutrients to produce spores and crystals, however, the comparison between what is produced between solid and liquid culture has a bias in terms of the amount of nutrients in the media or supports used. The use of inert supports such as polyurethane foam allows a fair comparison between both cultivation systems by being able to use the same medium. Although it has been shown that the use of inert supports such as polyurethane foam improves the production of B. thuringiensis spores and crystals even using the same culture medium in both systems, it is not clear which are the factors that influence this to be possible. In the work presented below, it is intended to determine the physiological and morphological changes that the bacterium undergoes when grown in both culture media to identify what factors influence the increase in the production and quality of spores and crystals. Two strains of B. thuringiensis were used, which were cultivated in media with high glucose concentration, in liquid culture and solid culture. During different sampling times, the amount of biomass and spores produced was determined. Being a bacterium capable of producing biofilm, it was determined whether there was retention of the product on the polyurethane foam walls by scanning electron microscopy and its recovery with washing the foam with a Tween 80 or sodium chloride solution. Quality tests were carried out on what was produced by these strains, the resistance to thermal shock of the spores was determined, as well as a bioassay with Galleria mellonella larvae. In addition to them, the production of the insecticidal crystal (Cry) in both culture systems and the morphological changes suffered by the bacteria when growing in the different culture systems by optical microscopy were corroborated. As previously demonstrated, culture in solid medium improves the production of biomass and spores of B. thuringiensis, even without considering what is retained in the polyurethane foam, with scanning electron microscopy it could be observed that after the extraction of bacteria from polyurethane foam, many cellular debris remain adhered to the foam walls, even after washing (either with Tween 80 or Sodium Chloride). Using two identified strains of B. thuringiensis, Cry protein production was verified by SDS-PAGE at least in culture on solid medium. In addition to corroborating the presence of the insecticidal protein by means of electrophoresis, observations were made in light microscope identifying the traditional forms of these crystals, as well as of the spores produced by B. thuringiensis, both in solid medium. A drastic morphological change was also observed in the morphology of the bacilli produced in liquid culture compared to the growth form of the bacteria in solid culture, the production of irregular inclusions in the bacilli which were not identified is observed. Likewise, an increase was obtained in the quality characteristics of the spores produced by solid culture compared to liquid culture, better resisting a drastic change in temperature, and showing greater infectivity against Galleria mellonella larvae. In conclusion, the physiological and morphological changes produced using media with a high concentration of glucose in solid and liquid culture have an important impact on the production and quality of the B. thuringiensis products obtained. Demonstrating that solid medium culture is an alternative to produce this type of compound.
Bacillus thuringiensis es una bacteria mundialmente conocida por la capacidad de producir cristales con características insecticidas, esta propiedad ha sido utilizada para la elaboración de formulados comerciales que han logrado posicionarse entre los más vendidos en el mercado de los bioinsecticidas. En la última década se ha explorado al cultivo en medio sólido como una alternativa para la producción de B. thuringiensis, mejorando los rendimientos de esporas y cristales que esta bacteria produce. Principalmente se han utilizado residuos agroindustriales como soporte y fuente de nutrientes para la producción de esporas y cristales, sin embargo, la comparación entre lo producido entre cultivo sólido y líquido tiene un sesgo en cuanto a la cantidad de nutrientes en los medios o soportes utilizados. El uso de soportes inertes como la espuma de poliuretano permite una comparación justa entre ambos sistemas de cultivo al poder utilizar el mismo medio. Aunque se ha demostrado que el uso de soportes inertes como la espuma de poliuretano mejora la producción de esporas y cristales de B. thuringiensis aun utilizando el mismo medio de cultivo en ambos sistemas, no es claro cuáles son los factores que influyen para que esto sea posible, en el trabajo que se presenta a continuación se pretende determinar los cambios fisiológicos y morfológicos que sufre la bacteria al cultivarse en ambos medios de cultivo para identificar qué factores influyen en el aumento en la producción y calidad de las esporas y cristales. Se utilizaron dos cepas de B. thuringiensis, las cuales fueron cultivadas en medios con alta concentración de glucosa, en cultivo líquido y cultivo sólido. Durante diferentes tiempos de muestreo se determinó la cantidad de biomasa y esporas producidas. Al ser una bacteria capaz de producir biopelícula se determinó si existía retención del producto en las paredes de espuma de poliuretano por microscopia electrónica de barrido y recuperación de esta con un lavado a la espuma con solución de Tween 80 o cloruro de sodio. Se realizaron pruebas de calidad a lo producido por estas cepas, se determinó la resistencia a choque térmico de las esporas, así como un bioensayo con larvas de Galleria mellonella. Además de ellos se corroboro la producción del cristal insecticida (Cry) en ambos sistemas de cultivo y los cambios morfológicos que sufre la bacteria al crecer en los diferentes sistemas de cultivo por microscopia óptica. Como se había demostrado antes, el cultivo en medio sólido mejora la producción de biomasa y esporas de B. thuringiensis, aun sin considerar lo retenido en la espuma de poliuretano, con microscopia electrónica de barrido se pudo observar que después de la extracción de las bacterias de la espuma de poliuretano, una gran cantidad de restos celulares quedan adheridos a las paredes de la espuma, aun después de realizar un lavado (ya sea con Tween 80 o Cloruro de sodio). Haciendo uso de dos cepas identificadas de B. thurigiensis, se comprobó la producción de proteína Cry por SDS-PAGE al menos en cultivo en medio sólido. Además de corroborar por medio de electroforesis la presencia de la proteína insecticida, se realizaron observaciones en microscopio óptico identificando las formas tradicionales de estos cristales, así como de las esporas producidas por B. thuringiensis ambas en medio sólido. Se observo también un cambio morfológico drástico en la morfología de los bacilos producidos en cultivo líquido en comparación con la forma de crecimiento de la bacteria en cultivo sólido, se observa la producción de inclusiones irregulares en los bacilos los cuales no fueron identificados. Asimismo, se obtuvo un aumento en las características de calidad de las esporas producidas por cultivo sólido en comparación con el cultivo líquido, resistiendo mejor a un cambio drástico de temperatura y mostrando mayor infectividad contra larvas de Galleria mellonella. Como conclusión, lo cambios fisiológicos y morfológicos producidos por el uso de medios con alta concentración de glucosa en cultivo sólido y líquido tienen una repercusión importante en la producción y calidad de los productos de B. thuringiensis obtenidos. Demostrando que el cultivo en medio sólido es una alternativa para la producción de este tipo de compuestos.
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