Desde 1958 ha existido cierta controversia respecto a si el tratamiento térmico de la leche previo a la hidrólisis de la lactosa puede o no aumentar la actividad de la lactasa (Fox, 1998; Greenberg y Mahoney, 1983; 1984; Kosikowski y Wiezbicki, 1973; Mahoney y Adamchuck, 1980; Wendorf y col., 1970; 1971). Aunque se han planteado varias posibles explicaciones, como aquella en la que el efecto se debe a la destrucción de un inhibidor termolábil, o a un cambio en el equilibrio salino de la leche, o bien a la desnaturalización térmica de las proteínas, a la fecha, la polémica sobre esta situación no ha sido resuelta. Este trabajo estuvo encaminado a determinar cuáles de los cambios que se producen por el tratamiento térmico de la leche, tienen algún efecto sobre la actividad de la β-galactosidasa de Kluyveromyces lactis. En una primera etapa del proyecto se llevaron a cabo estudios calentando leche, suero de leche, permeado de suero y soluciones puras de las 3 principales proteínas del suero, con y sin lactosa, en un rango de temperaturas entre 55 y 85°C, para después determinar la actividad de la lactasa en estos medios a 37°C. Se comprobó que el calentamiento de la leche sí produce un aumento en la actividad de la lactasa, principalmente entre 55 y 65°C. El calentamiento del suero, por otro lado, causó una disminución de la actividad entre 55 y 75°C, así como un aumento de la misma al calentarlo a 85°C Con la obtención de los patrones electroforéticos, espectros de absorción y concentración de SH, se determinaron los cambios provocados por el calentamiento en la conformación de las principales proteínas del suero, y se correlacionaron con el cambio en la actividad de la enzima. Se observó que la β-lactoglobulina (β-lg) sufre cambios conformacionales fuertes a las temperaturas probadas y expone y/o libera grupos SH al medio, los cuales son capaces de aumentar la actividad de la enzima. Se determinó además que la sola presencia de β-lg (sin calentamiento) en el medio de reacción es capaz de aumentar la tasa de hidrólisis de lactosa y que durante el calentamiento (independientemente de la temperatura) en presencia de lactosa, la β-lg se “lactosila”, perdiendo con ello su capacidad activadora. Utilizando β-lg o β-lactoglobulina lactosilada como ligando en cromatografía de afinidad se determinó que la β-galactosidasa se une fuertemente a la β-lg. Este podría ser el mecanismo por el cual se da la activación de la enzima. Se determinó también que cuando la β-lg se lactosila disminuye su capacidad de unirse a la enzima, que probablemente se traduce en la disminución de su capacidad activadora. A partir de los resultados anteriores se demostró que el efecto del calentamiento de la leche sobre la actividad de la β-galactosidasa es un fenómeno multifactorial y complejo. Al respecto, en este trabajo se demostró que la activación de la enzima no ocurre por la destrucción de algún inhibidor termolábil de naturaleza no protéica, sino que el efecto está relacionado principalmente con los cambios que se dan en el sistema proteico de la leche como consecuencia del calentamiento. Se comprobó que el sistema protéico de la leche puede afectar a la actividad de la enzima en al menos dos formas: a través de la exposición de grupos reactivos que puedan activar a la enzima, o bien a través de interacciones entre las proteínas y la enzima. La primera involucra cambios de algunas proteínas del suero, principalmente la β-lactoglobulina; la cual, a través de la exposición y/o liberación de grupos SH reactivos debido a los reacomodos de su estructura provoca un aumento en la tasa de reacción de la enzima. Y la segunda, que implica el efecto de la seroalbúmina y la βlactoglobulina per se. Se demostró además que el efecto activador de la βlactoglobulina se debe a que ésta se une fuertemente a la enzima y que tal efecto se pierde al glicosilar a la β-lg calentándola en presencia de lactosa, probablemente debido a que la región de la molécula involucrada en la lactosilación (en la cercanía de la lys47) es la misma involucrada en la unión entre la β-lg y la enzima.
Since 1958, there has been a controversyh with respect to whether or not the heat treatment of milk previous to lactose hydrolysis with β-galactosidase could increase the rate of reaction. Even though several possible explanations have been established such as the effect being due to the destruction of a thermo labile nonprotein inhibitor, to a shift in the saline equilibrium of milk, or rather to the thermal denaturation of milk proteins, today no explanation has been demonstrated, and the polemic to this matter remains unresolved. The aim of this work was to determine which or the changes induced in milk as a consequence of heat treatment have an effect on the activity of Kluyveromyces lactis β-galactosidase. In a first stage of the project studies were carried out heating milk, milk whey, whey permeate and pure solutions of the 3 most abundant proteins in whey, heated with or without lactose, in a temperature range from 55 to 85°C. Lactase activity was determined after lowering the heat-treated media temperature to 37°C. It was demonstrated thatheat treatment of milk causes an increase in lactase activity, mainly when milk is treated between 55-65°C; treating whey at 85°C resulted in a significant increase in the activity. The extent of the conformational changes that whey proteins had undergone due to the heat treatment was determined through the analysis of electrophoretic patterns, absorption spectra and SH concentration of wheys treated at the temperatures stated above. Correlation tests between structural changes and enzyme activity established that the enzyme rate of reaction is strongly affected by the changes on the protein system of milk. Furthermore, it was observed that β-lactoglobulin (β-lg) undergoes strong conformational changes when heated at the temperatures studied, and these structural changes cause the exposure and/or release of reactive SH groups to the media, which may increase the activity of the enzyme. In this work, it was also determined that the sole presence of unheated β-lg or serum albumin (SA) in the reaction media increases the rate of lactose hydrolysis. More over, heating β-lg in buffer solutions increased activity even more; but when β-lg was heated in the presence of 5% lactose, it lost its ability to activate the enzyme, probably due to the glicosilation of β-lg with lactose: “lactolation” forming lactolated β-lg (β-lglac) which is unable to activate the enzyme. Using native β-lg or β-lglac as ligands in affinity chromatography tests, it was determined that ß-galactosidase binds strongly to ß-lg, which could be the mechanism through which ß-lg activates the enzyme. It was also determined that when ß-lg is lactolated its capacity to bind to the enzyme decreases, which is probably reflected in the diminution of its capacity to activate the enzyme. From the results obtained it was demonstrated that the effect of heat treatment of milk on lactase activity is a complex and multifactorial phenomenon. To this respect, in this work it was demonstrated that the activation of the enzyme is not due to the destruction of a non-protein inhibitor, but it is rather related mainly to the changes in the protein system of milk induced as a consequence of the heat treatment. It was also proved that the protein system of milk could affect the activity in at least two ways: either through the exposure of reactive groups which could activate the enzyme; or through interactions between the milk proteins and the enzyme. The first involves the conformation of whey proteins, mainly ß-lactoglobulin, which through the exposure and/or release of reactive SH groups due to the rearrangement or its molecule, causes an increase in the rate of reaction of the enzyme. The former implies the activating effect of serum albumin and ß-lg per se (independently of the heat treatment). It was also demonstrated that the activating effect of ß-lactoglobulin is due to its strong binding capacity to the enzyme, and that its activating capacity can be lost due to its lactolation when ß-lg is heated in the presence of lactose, this suggests that the region involvedin the glicolation (close to lys47) could be the same region involved in the binding of ß-lg to enzyme.
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