A contribution to the knowledge of denitrifying process in presence of toluene is presented. The effect of an easily degradable substrate such as acetate on toluene mineralization under denitrifying conditions was evaluated by means of consumption efficiencies, yield products and substrate specific consumption rates. Molecular techniques such as denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) and real-time PCR analysis were used in order to determinate whether a relationship between the structure of the community and toluene consumption exists. A stabilized denitrifying sludge without previous exposition to hydrocarbons was used as inoculum. The work was divided into three parts. At first, in order to examine the effect of acetate on toluene mineralization, an upflow anaerobic sludge blanket (UASB) reactor in steady state was set up. Initially, the reactor was fed with a carbon loading rate of 250 mg acetate- C/l-d as electron source. Nitrate loading rate (mg NO3 - -N /l-d) was adjusted to obtain a constant C/N ratio of 1.4. Later, acetate-C loading rate (mg acetate-C/l-d) was gradually substituted by toluene-C at five toluene-C loading rates (TLR, mg toluene-C/l-d), 25, 50, 75, 100 and 125. Total carbon loading rate and C/N were maintained constant at 250 mg C/l-d and 1.4, respectively. In the second part, continuous and batch cultures were carried out. In continuous assays, an UASB reactor was fed with different carbon loading rates (mg C/l-d) of acetate- C/toluene-C: 100/0, 75/25, 50/50 and 0/100. In these assays, the analysis of the dynamics of denitrifying community profile by DGGE, was studied. In batch assays, different acetate-C/toluene-C ratios (10/70, 30/50, 50/30 and 65/20 mg C/l), were evaluated. Assays with only toluene (mg C/l: 20, 30, 50 and 70) were done as control. In the third part, the oxidation of 15 mg of toluene-C/l in presence or absence of 90 mg of acetate-C/l was evaluated in batch culture. In these assays the number of bssA and 16S rDNA gene copies were quantified using real time quantitative PCR analysis. The results found in the first part showed that when acetate-C was the only electron source a dissimilative denitrifying process resulted as indicated by bicarbonate yield (YHCO3, mg HCO3 - produced/mg carbon consumed) of 0.74 0.005 and denitrifying yield (YN2, mg N2 produced/mg NO3 --N consumed) of 0.89 0.042. The addition of different TLR did not affect the biological process as consumption carbon efficiency (CCE) values remained up to 95% 3.5 and YHCO3 and YN2 values were higher than 0.71 0.03 and 0.88 0.01, respectively. In the second part it was found that as the acetate loading rate decreased in the culture, the carbon and nitrate consumption efficiency also decreased from 91 to 51% and from 99 to 65%. YHCO3 and YN2 values also decreased from 0.82 to 0.46 and 0.82 to 0.47. The analysis of the dynamics of denitrifying community profile by DGGE indicated that there was no prevalence of a certain microbial population in the assays with different acetate- C/toluene-C ratios. The results in batch assays indicated that the specific consumption rate of toluene (qT) was two times higher at 20 mg toluene-C/l in presence of 65 mg acetate-C/l as compared to assays with 20 mg toluene-C as solely electron source. Therefore, the presence of acetate improved the qT. The results in the third part corroborated that the specific consumption rate of toluene improved in the presence of acetate. Real time quantitative PCR analysis showed that the highest number of bssA gene copies occurred in presence of toluene, whereas the highest number of 16S rDNA gene copies was observed in assays with acetate. These results suggest that acetate enhanced the bacteria growth leading to an increase in toluene consumption rate.
El presente trabajo pretende contribuir al estudio de la eliminación de tolueno mediante la desnitrificación, así como al entendimiento de las interacciones entre las respuestas fisiológicas dentro de un consorcio desnitrificante y la estructura de la comunidad microbiana presente. Se puso Énfasis en estudiar la influencia de una fuente fácilmente oxidable sobre la eliminación de dicho hidrocarburo, la cual fue evaluada a través de variables de respuesta fisiológicas tales como eficiencias de consumo, rendimientos de producto y velocidades específicas de consumo de substrato. Para lograr entender con mayor profundidad las interacciones entre las respuestas fisiológicas y la estructura microbiana el trabajo se apoya en algunos métodos de biología molecular como el de electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE) y el de la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (PCR-RT). El trabajo se dividió en tres partes, en cada una de estas se utiliza un consorcio desnitrificante fisiológicamente estable que no presentaba un contacto previo con hidrocarburos. En una primera parte se examinó en cultivo continuo el efecto del acetato como una fuente fácilmente oxidable sobre la mineralización de tolueno por desnitrificación. En los ensayos se usó un reactor UASB que primero se alimentó con acetato a una velocidad de carga de 250 mg C-acetato/l-d y una carga de nitrógeno de nitrato de 171 mg N-NO3 -/l-d. Posteriormente 5 velocidades de carga de tolueno (mg C-tolueno/l-d) fueron evaluadas (25, 50, 75 100 y 125), manteniendo constante la velocidad de carga de carbono total de 250 mg C/l-d y una relación C/N de 1.4. En estos ensayos la velocidad de carga de acetato fue disminuyendo gradualmente, pero sin eliminarse totalmente del sistema. En una segunda parte, también se evaluó en cultivo continuo y en lote el efecto del acetato sobre el consumo del tolueno. En este caso, para los ensayos en continuo se eliminó totalmente el acetato de la alimentación, evaluando velocidades de carga de acetato-C/tolueno-C entre 100/0 y 0/100 mg C/l-d. Además, en estos ensayos se estudia la estructura de las poblaciones microbianas mediante la técnica molecular de DGGE. En los ensayos en lote se evaluaron distintas concentraciones de tolueno (10-70 mg C/l) en ausencia y presencia de acetato (10-70 mg C/l). La tercera parte del trabajo se realizó en cultivo en lote donde se evaluaron concentraciones de tolueno (en ausencia y presencia de acetato) distintas a las evaluadas ii en los ensayos antes mencionados. Además de que, en estos ensayos, aunado a las variables de respuesta fisiológicas, se analiza mediante la técnica de PCR-RT, la presencia de genes catabólicos del tolueno como el bssA que codifica para la enzima benzilsuccinato sintasa, así como de genes constitutivos como el 16S DNAr. Los resultados de la primera parte mostraron eficiencias de consumo de acetato y tolueno mayores que 95% y de nitrato superiores a 87%. Los rendimientos de carbono (YHCO3) alcanzaron valores de 0.71, mientras que los de nitrógeno (YN2) oscilaron alrededor de 0.88. Los resultados muestran que el proceso desnitrificante no se vio afectado aún a velocidades de carga de tolueno ensayadas de 125 mg C/l-d. En la segunda parte del trabajo, para el caso de los ensayos en continuo se encontró que conforme la velocidad de carga de acetato disminuyó gradualmente hasta eliminarse totalmente en el cultivo, las eficiencias de consumo de carbono y nitrógeno también descendieron de 91 a 61% y de 99 a 65%, respectivamente. Los YHCO3 y YN2 también decrecieron desde 0.82 a 0.46 y 0.82 a 0.47, respectivamente. El análisis del perfil de bandas obtenido mediante la técnica de DGGE reveló un mayor número de poblaciones microbianas en los ensayos con las mezclas acetato/tolueno, aunque no se encontró algún predominio de Éstas, descartando alguna presión selectiva debido al incremento del tolueno en el cultivo. En los ensayos en lote se observó que la velocidad específica de consumo de tolueno (qT) incrementó con la presencia de acetato, ya que mientras la qT con 15 mg C-tolueno/l fue de 0.006 mg C/mg SSV-d, la qT a la misma concentración de tolueno, pero en presencia de 65 mg C-acetato/l, fue de 0.013 mg C/mg SSV-d, es decir, la velocidad específica de consumo de tolueno fue duplicada en presencia de acetato. Los ensayos en lote realizados en la tercera parte del estudio también mostraron un efecto coadyuvante del acetato sobre la velocidad específica de consumo de tolueno. El análisis de PCR-RT mostró que el mayor número de copias del gen bssA se encontró en los ensayos que presentaban tolueno, comparado con los de sólo acetato. Sin embargo, para el caso del gen 16S DNAr se presentó un efecto contrario, encontrando un mayor número de copias en los ensayos que presentaban acetato, lo que podría indicar que mientras el tolueno promovió el crecimiento de bacterias que albergan el gen bssA, el acetato promovió el crecimiento de bacterias totales, lo que provocó un incremento en la velocidad específica de consumo de tolueno.
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