Análisis de las interacciones fisicoquímicas y ecológicas en los mecanismos de antagonismo entre hongos ocratoxigénicos presentes en cerezas de café y bacterias ácido lácticas Público Deposited
Coffee is considered a product of great importance in world trade. However, since 1960 the presence of mycotoxins has been detected in various foods, not just coffee. Mycotoxins, such as ochratoxin A (OTA), is associated with various neurotoxic, genotoxic, teratogenic disorders, among other disorders in animals and humans. In addition, the contaminated grains cause significant economic losses for the agricultural sector (932 million dollars / year). The main microorganisms that produce mycotoxins are fungi of the genus Aspergillus, Penicillium and Fusarium. Objective. With this background, the objective of this work is to determine the physicochemical and ecological interactions involved in the biocontrol of the Aspergillus carbonarius (considered as the largest producer of OTA in food) and the production of ochratoxin A in coffee beans, with the application of lactic acid bacteria "Lactobacillus plantarum" endemic of coffee pulp. Understanding the mode of action of L. plantarum and the influence of physicochemical factors on the bacterium-fungus interaction will generate biotechnological alternatives that allow making recommendations to prevent, control or eliminate ochratoxin A from coffee crops. Methods. For this purpose, using scanning electron microscopy (SEM), confocal laser scanning microscopy (CLSM), atomic force microscopy (AFM), light field microscopy (LFM), Zeta potential (ZP), Fouriertransform infrared spectroscopy (FTIR), the physicochemical mechanisms in the cell-cell interaction are studied making surface characterizations such as roughness, topography, chemical composition, surface charge and hydrophobicity of both microorganisms, which could be involved in the adhesion between both microorganisms and their association with the biocontrol of A. carbonarius. Results. We determined that L. plantarum inhibits fungal (radial) development in solid medium above 50% for 5-6 days (fungistatic biocontrol). The maximum inhibition (84%) is reached on the fourth day, using bacterial inoculum of 5x104 cell/mL. In the co-cultures in liquid medium we observed the effect of biocontrol on the germination of fungal spores up to 72 h. On the other hand, the production of L-lactic acid, D-lactic acid, formic acid, acetic acid, propionic acid and ethanol was characterized by HPLC, as fermentation products of trehalose by L. plantarum, molecules suggested in literature regarding fungal biocontrol. Interaction studies (co-culture) showed bacterial adhesion on the surface of fungal spores as antagonist mechanism, classified in literature as direct antagonism. In addition to this, possible damage to the surface of fungal spores was determined by the presence of membrane pores of approximately 140 ± 22.3 nm, which could be related to the biocontrol of the mycotoxigenic fungus. In addition to this study, the capacity of OTA adsorption on the surface of L. plantarum was determined. Finally, the mechanisms responsible for superficial adhesion of lactic acid bacteria on fungal spores were analyzed. The PZ of bacteria and fungi (-11 a -18 mV y 0 a -10 mV respectively) they do not support the hypothesis of electrostatic attraction as the mechanism responsible for adhesion (observed in SEM). On the other hand, the roughness and topography theoretically suggest that roughness could be a determining factor in the bacterial adhesion. However the numerical value of superficial roughness of fungal spores estimated under the arithmetic average of the absolute values of the heights Ra = 0.097±0.031 µm, it does not relate to a great extent the roughness with the adhesion observed. On the other hand, by LCSM and FTIR, superficial chemical bonds were determined, which were associated to proteins and polysaccharides as possible membrane biomolecules involved in the adhesion of L.plantarum on spores of A. carbonarius. Finally, the results obtained in this work propose the effective use of L. plantarum as an alternative for the control of A. carbonarius. Likewise, the physical, chemical and ecological mechanisms of biocontrol studied in this work allow us to understand the mode of action of L. plantarum, which broadens possibilities and opportunities to generate new biotechnological alternatives against fungal contaminants of crops and their mycotoxins.
El café es considerado un producto de gran importancia en el comercio mundial. Sin embargo, desde 1960 se ha detectado la presencia de micotoxinas en diversos alimentos no solo el café. Las micotoxinas, como la ocratoxina A (OTA), está asociada a diversos trastornos de tipo neurotóxico, genotóxico, teratogénico, entre otros desordenes en animales y humanos. Además, los granos contaminados ocasionan importantes pérdidas económicas para el sector agrícola (932 millones de dólares/ año). Los principales microorganismos productores de micotoxinas son hongos del genero Aspergillus, Penicillium y Fusarium. Objetivo. Con este antecedente, el objetivo de este trabajo es determinar las interacciones fisicoquímicas y ecológicas implicados en el biocontrol del hongo Aspergillus carbonarius (considerado como mayor productor de OTA en alimentos) y la producción de ocratoxina A en frutos de café, con la aplicación de bacterias acido lácticas “Lactobacillus plantarum” endémicas de pulpa de café. Comprender el modo de acción de L. plantarum y la influencia de los factores fisicoquímicos en la interacción bacteria-hongo generará alternativas biotecnológicas que permitan hacer recomendaciones para prevenir, controlar o eliminar la ocratoxina A de las plantaciones de café. Métodos. Para tal propósito haciendo uso de microscopia electrónica de barrido (MEB), microscopia de barrido laser confocal (CLSM), microscopia de fuerzas atómicas (MFA), microscopia en campo claro (MCC), potencial Zeta (PZ), espectrometría infrarroja de transformada de Fourier (FTIR) se estudian los mecanismos fisicoquímicos en la interacción célula-célula realizando caracterizaciones superficiales como rugosidad, topografía, composición química, carga superficial e hidrofobicidad de ambos microorganismos, que pudiesen estar implicados en la adhesión entre ambos microorganismos y su asociación con el biocontrol de A. carbonarius Resultados. Determinamos que L. plantarum inhibe el desarrollo (radial) fúngico en medio solido por encima del 50% durante 5-6 días (biocontrol fungistático). La máxima inhibición (84%) se alcanza al cuarto día, utilizando inóculo bacteriano de 5x104 cel/mL. En los cocultivos en medio líquido pudimos observar efecto de biocontrol en la germinación de esporas fúngicas de hasta 72 h. Por otra parte, se caracterizó por HPLC la producción de ácido L-láctico, ácido D-láctico, ácido fórmico, ácido acético, ácido propiónico y etanol, como productos de fermentación de trehalosa por L. plantarum, moléculas sugeridas en bibliografía con relación al biocontrol fúngico. Los estudios de interacción (co-cultivo), mostraron adhesión bacteriana sobre la superficie de esporas fúngicas como mecanismo antagónico, clasificado en bibliografía como antagonismo directo. Aunado a esto se determinó posible daño sobre la superficie de esporas fúngicas por la presencia de poros membranales de aproximadamente 140 ± 22.3 nm, que podrían estar relacionadas con el biocontrol del hongo micotoxigénico. Aunado a este estudio se determinó la capacidad de adsorción de OTA sobre la superficie de L. plantarum Por último se analizaron los mecanismos responsables de adhesión superficial de bacterias lácticas sobre esporas fúngicas. El PZ de bacterias y hongos (-11 a -18 mV y 0 a - 10 mV respectivamente), no apoyan la hipótesis de atracción electrostática como mecanismo responsable de la adhesión (observada en MEB). Por otra parte, la rugosidad y topografía teóricamente sugieren que la rugosidad podría ser un factor condicionante en la adhesión bacteriana. Sin embargo el valor numérico de rugosidad superficial de esporas fúngicas estimados bajo el promedio aritmético de los valores absolutos de las alturas Ra = 0.097±0.031 µm, no relaciona en gran medida la rugosidad con la adhesión observada. Por otra parte, mediante CLSM y FTIR, se determinaron enlaces químicos superficiales los cuales se asociaron a proteínas y polisacáridos como posibles biomoléculas membranales implicadas en la adhesión de L.plantarum sobre esporas de A. carbonarius. Finalmente, los resultados obtenidos en este trabajo proponen el uso eficaz de Lactobacillus plantarum como alternativa para el control de A. carbonarius. Así mismo los mecanismos físicos, químicos y ecológicos de biocontrol estudiados en este trabajo permiten comprender el modo de acción de L. plantarum lo cual amplía posibilidades y oportunidades para generar nuevas alternativas biotecnológicas en contra de los hongos contaminantes de cultivos y sus micotoxinas.
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