Producción de oxigenasas de hidrocarburos por Aspergillus niger por fermentación en estado sólido Público Deposited
Recently, the solid state fermentation (SSF) has been regarded as a big potential process for the development of bioprocesses and products. Among their applications one can find enzyme production that is mainly extracellular. The oxygenases are intracellular enzymes that catalyze reactions in which oxygen atoms from molecular oxygen are directly incorporated into the substrate to form a new hydroxyl or carbonyl group. There are two kinds of oxygenases, the monooxygenases/hydroxylases that catalyze the insertion of only one of the oxygen atoms and the dioxygenases/hydroxylases that catalyze the insertion of both oxygen atoms. The oxygenases have a crucial role in the metabolism and the biosynthesis. They have been used to eliminate pollutants from air, soil and water. Furthermore, in the last ten years, they have become important for the pharmaceuticals design and the production of specialty chemicals. In this thesis it is presented the study of hexadecane consumption by Aspergillus niger, ATCC 9642, with and without glucose by submerged fermentation (SmF) and by solid state fermentation (SSF). This study was undertaken with the aim of selecting a suitable culture medium to produce biomass with oxygenase activity. Oxygenase activity was evaluated in resting cells and in enzyme extracts of biomass obtained by both fermentation systems. The oxygenase was also characterized in terms of activity, stability and specificity. The carbon sources used in both SmF and SSF were different mixtures of glucose and hexadecane. In most of the experiments the ratio C/N ratio was (12.12), the exception was a SSF test were a C/N (16.24) was used. The results include the kinetic characterization of both fermentation systems. They show that independently of the system, the use of glucose as cosubstrate increases the specific growth rate ( ), the specific substrate consumption rate (qS) and the biomass yield with respect of substrate (YSX), compared with the values obtained with hexadecane as sole carbon source. The increases in these parameters are always larger for FEL. However, not all cases had been consumed hexadecane in FEL, while FES always presented hexadecane consumption and this was significantly higher than for the case of FEL. In both fermentation systems, the mineralization of the substrate consumed is greater when using a mixture of substrates, that when using glucose or hexadecane as sole sources of carbon. The respiratory coefficients in both systems were higher than 1.0 when only glucose was consumed. Their values were very close to the theoretical value when hexadecane was consumed in the presence of glucose. The study of water soluble metabolites during the liquid and solid cultures of A. niger with hexadecane and glucose (50 % C-glu, 50 % C-hxd) showed a rapid consumption of glucose with accumulation of citric acid and fructose in SSF. However, no accumulation of any metabolite was detected in FEL. Cell-free extracts obtained by SSF and SmF were concentrated by dehydration or stored at -20 oC to study the oxygenase stability. It was found that the enzymatic extracts lost about 75% of the initial activity in only 7 days at -20 oC and a similar effect was shown by dehydration. The loss of activity was independent of the fermentation system. The measurements of oxygenase activity at different temperatures yield two peaks of activity at 26 and 35 oC. The activities reported in this test were significantly different with an = 0.05 using a t-student test. The oxygenase produced under SSF have no specificity difference for aliphatic hydrocarbons (linear and non linear). But, it increases for aromatic substrates as the complexity of the ring increases. Oxygenase produced under SmF has no specific pattern of specificity. It has activity with aliphatic as well as with aromatics. Albeit, the activities were significantly different and lower, at least 7-folds, compared to SSF. Key words: oxygenases, solid state fermentation, aromatic hydrocarbons, hexadecane, polyurethane matrix support, Aspergillus niger.
En los últimos años la fermentación en estado sólido (FES) se ha considerado como un proceso con un gran potencial en el desarrollo de bioprocesos y de productos. Entre sus aplicaciones está la obtención de enzimas. Las enzimas que se obtienen mediante este proceso son principalmente extracelulares. Las oxigenasas son enzimas intracelulares que catalizan reacciones en las cuales los átomos de oxígeno, provenientes de oxígeno molecular, son directamente incorporados en el substrato, formando un nuevo grupo hidroxilo o carbonilo. Existen dos tipos de oxigenasas, las monooxigenasas/hidroxilasas que catalizan la inserción de un solo átomo de oxígeno y las dioxigenasas/hydroxilasas que catalizan la inserción de ambos átomos de oxígeno. Las oxigenasas tienen un papel primordial en el metabolismo y en la biosíntesis. Han sido utilizadas en la remoción de contaminantes de aire, suelo y agua. En los últimos diez años han adquirido una gran importancia en el diseño de medicamentos y en la producción de compuestos de alto valor agregado. En esta tesis se estudió el consumo de hexadecano por Aspergillus niger ATCC 9642 en FEL y en FES en presencia y ausencia de glucosa, con el propósito de seleccionar un medio de cultivo adecuado para producir biomasa con actividad oxigenasa. La actividad oxigenasa fue evaluada en células en reposo y en extractos enzimáticos de la biomasa obtenida por ambos sistemas de fermentación. Las fuentes de carbono usadas en ambos sistemas de fermentación fueron mezclas de glucosa y hexadecano, en diferentes proporciones, pero con la misma relación C/N (12.12). Excepto para un caso de fermentación sumergida en donde se aumentó la relación C/N (16.24). Los resultados incluyen la caracterización cinética de ambos sistemas de fermentación. Entre éstos podemos mencionar que, en ambos sistemas con el uso de glucosa como cosubstrato, se incrementan las tasas específicas de crecimiento ( ), las tasas específicas de consumo de substrato (qS) y los rendimiento de biomasa con respecto al substrato (YSX), comparados con los valores obtenidos cuando sólo se usa hexadecano como substrato. Los aumentos en estos parámetros siempre son mayores para FEL. Sin embargo, no en todos los casos hubo consumo de hexadecano en FEL, mientras que en FES siempre se presentó consumo de hexadecano y el consumo fue en mayores porcentajes que para los casos de FEL. En ambos sistemas de cultivo, la mineralización del substrato consumido es mayor cuando se usa una mezcla de substratos, que cuando se usan glucosa o hexadecano como fuentes únicas de carbono. Los coeficientes respiratorios en ambos sistemas fueron mayores de 1.0 cuando sólo se consumió glucosa. Sus valores fueron muy cercanos al valor teórico cuando se consumió hexadecano en presencia de glucosa. Se llevó a cabo un análisis de los metabolitos hidrosolubles presentes en cultivos líquido y sólido de A. niger con hexadecano y glucosa (50 % C-glu, 50% C-hxd). En el cultivo sólido se observó un rápido consumo de glucosa con acumulación de ácido cítrico y de fructosa. En el cultivo líquido no se observó acumulación de algún metabolito. Se analizó la estabilidad de las oxigenasas en los extractos libres de células obtenidos en FEL y en FES, con tratamientos como la concentración por deshidratación y el almacenamiento a -20 oC de los extractos. Se encontró que los extractos enzimáticos pierden alrededor de 75 % de la actividad inicial tanto por el efecto de la concentración como por el almacenamiento durante 7 días a -20 oC. La pérdida de actividad fue similar independientemente del método de obtención de las mismas. Se observó el efecto de la temperatura en la actividad oxigenasa y se encontró que se presentan dos máximos de actividad, uno a 26 y otro a 35 oC. Las actividades registradas para esta prueba son significativamente diferentes con un =0.05 Se estudió la especificidad de las oxigenasas, obtenidas en cultivo líquido y analizadas con una prueba t-student. en cultivo sólido, encontrándose que el extracto enzimático obtenido en FES no tiene una especificidad diferente para hidrocarburos alifáticos (lineales o ramificados). Sin embargo, la especificidad para compuestos aromáticos se incrementa con la complejidad del anillo. La mayor especificidad se presenta con tolueno y pireno. La actividad del extracto enzimático de FEL no presenta un patrón determinado y muestra actividad tanto con aromáticos como con alifáticos. Se evaluó la actividad oxigenasa en extractos enzimáticos de biomasa obtenida tanto en FEL como en FES, encontrándose que la actividad es significativamente diferente para la biomasa de ambos sistemas de fermentación. La actividad del extracto enzimático de FEL es por lo menos 7 veces menor que la actividad en FES. Palabras clave: oxigenasas, fermentación en estado sólido, hidrocarburos aromáticos, hexadecano, soporte de poliuretano, Aspergillus niger.
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