Producción de compuestos activos en suspensiones celulares de Tilia americana var. mexicana, por estimulación abiótica empleando el modelo de superficie de respuesta Public Deposited
La producción de los compuestos activos estuvo asociada al crecimiento celular, la máxima biomasa y producción de metabolitos se obtuvo a los 14 días de cultivo y no se observó excreción al medio de cultivo. La producción de los compuestos escopoletina y del 3-O-β-D-glucósido de quercetina se estimuló mediante la modificación de las condiciones nutrimentales del medio MS, nitratos totales y cobre, reportados como elicitores abióticos para incrementar la producción de compuestos fenólicos. Para tal propósito, se empleó la Metodología de Superficie de Respuesta (MSR) que consiste en establecer el Diseño Factorial (DF) 2 K , en donde las variables independientes X1 = nitratos totales (27.4 mM, 11.5 mM KNO3 y 15.9 mM NH4NO3) y X2 = cobre (0.1 μM CuSO4) se codificaron en dos niveles (+1, -1), establecidos a partir de los valores iniciales de estas sales en el medio de cultivo MS completo. Dichos valores iniciales se tomaron como los puntos centrales del diseño. Las tres variables a optimizar fueron la biomasa máxima (Y1 = Bmáx) y la producción de escopoletina (Y2) y de glucósido de quercetina (Y3). De acuerdo con los coeficientes β del modelo obtenido con los resultados del DF 2K , el efecto negativo de los nitratos totales y el efecto positivo del cobre indicaron que, de manera independiente o en combinación, los niveles de nitratos totales deben reducirse y el cobre debe incrementar para optimizar el crecimiento de la suspensión celular. Los mayores valores de biomasa máxima en peso seco (Bmáx) se obtuvieron con 13.7 mM de NO3 - en combinación con 1 µM Cu2+. El DF 2 K mostró que la reducción de nitratos, así como el incremento en las concentraciones de cobre, independientemente o en combinación, favorecieron la producción de escopoletina; mientras que para la producción de 3-O-β-Dglucósido de quercetina las concentraciones de nitratos y cobre deben disminuir independientemente o en combinación. La siguiente etapa consistió en completar el DF 2 K para tener un Diseño Compuesto Central (DCC), agregando los puntos 1.414, 0, 1.414 correspondientes al diseño de estrella (Montgomery y Evans, 1975; Montgomery et al., 2012). Con el desarrollo del DCC fue posible identificar el punto de inflexión en la concentración de los elicitores para estimular la producción de escopoletina y 3-O-β-D-glucósido de quercetina, considerando como variable los rendimientos. Los coeficientes β del modelo del DCC indicaron que la concentración de nitratos totales debe reducirse y/o la concentración de cobre incrementar, de manera independiente uno del otro en la formulación del medio de cultivo MS, para favorecer la producción de escopoletina.
La máxima producción de escopoletina (que significó un incremento de aproximadamente 3 veces respecto a la producción inicial) se obtuvo en los medios que contenían 27.4 mM de NO3 - y 1.2 µM de Cu2+ . Por el contrario, para favorecer la producción del 3-O-β-D-glucósido de quercetina, las concentraciones de nitratos totales y cobre deben reducirse de manera independiente uno del otro en la formulación del medio de cultivo MS. La mejor condición para incrementar, aproximadamente 3 veces la producción de este compuesto se obtuvo en el medio que contenía 8.03 mM de NO3 - y 0.1 µM de Cu2+. El contenido de NO3 - y Cu2+ que favorece la producción de escopoletina y 3-O-β-D-glucósido de quercetina afectó el crecimiento celular de la suspensión celular de T. americana var. mexicana; a partir de lo anterior, la mejor condición para incrementar el crecimiento celular se alcanzó al utilizar 13.7 mM de NO3 - y 1 µM de Cu2+ . La última etapa de la investigación consistió en evaluar el extracto metanólico (TaM) del cultivo de células en suspensión desarrollado en el medio MS basal, y las fracciones derivadas del extracto íntegro en un modelo murino de úlceras gástricas inducido con etanol absoluto. El fraccionamiento cromatográfico del TaM permitió obtener 17 fracciones, de las cuales tres de ellas presentaron compuestos de naturaleza cumarínica: esculetina y esculina (TaMC2-5 y TaMC2-9) y escopoletina (TaMC2-13); la subfracción TaMC2-5 presentó derivados del ácido gálico y de la subfracción TaMC2-13 se aisló el ácido p-cumárico. Los ratones tratados con el extracto TaM (70.14 ± 19.33%) y la fracción TaMC2-9 (78.27 ± 11.88%) mostraron un efecto gastroprotector similar a las concentraciones evaluadas; este efecto podría deberse a la presencia de las cumarinas. El extracto íntegro TaM presentó la mezcla de esculetina, esculina y escopoletina entre otros compuestos, y en la fracción TaMC2-9 están presentes esculetina y esculina. Para demostrar su efecto es necesario purificar estas cumarinas y evaluarlas de manera individual, así como analizar las citocinas pro y antiinflamatorias de los estómagos de los ratones tratados con TaM y TaMC2-9 conocer de manera molecular el efecto gastroprotector presentado. La escopoletina ha demostrado inhibir la biosíntesis de la prostaglandina PGE2, el factor de necrosis tumoral TNF-α y las interleucinas proinflamatorias IL-1β e IL-6; además de suprimir la expresión de la isoforma 2 de la COX-2 a una concentración dosis dependiente (1-50 µg mL-1 ) en un modelo in vitro de inflamación.
Tilia americana var. mexicana es un árbol ampliamente distribuido en el territorio nacional, cuyas flores y brácteas son utilizadas principalmente en la medicina tradicional mexicana debido a efectos sedantes y ansiolíticos, propiedades que las hacen populares para tratar padecimientos como el insomnio y los “nervios”. Estas propiedades farmacológicas se han atribuido principalmente a los derivados glicosilados de la quercetina y el kaempferol como el 3-O-β-D-glucósido de quercetina y el tilirósido. Otros de los usos tradicionales que se le han atribuido a esta especie han sido para tratar la gastroenteritis, las hemorroides, el dolor y el reumatismo. Debido a la tala inmoderada de los árboles de tilia por la explotación de su madera y la comercialización de sus inflorescencias, la SEMARNAT ha identificado a este árbol con base en la NOM-059-SEMARNAT-2010 como una especie en peligro de extinción. Una alternativa para proteger y promover el uso racional de esta especie es mediante el empleo de técnicas biotecnológicas como el cultivo de tejidos vegetales, tal es el caso del cultivo de células en suspensión que permite disponer de material vegetal productor de los compuestos responsables de las actividades biológicas que se le atribuyen. En este trabajo de investigación, a partir de un cultivo de callos derivados de explantes de hoja, se estableció un cultivo tipo lote de células en suspensión de T. americana var. mexicana en matraces Erlenmeyer de 250 mL, con medio de cultivo de Murashige y Skoog (MS) completo en sales (27.4 mM de nitratos totales y 0.1 µM de cobre) suplementado con 2.0 mg L-1 de ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D), 0.5 mg L-1 kinetina (KIN), 30.0 g L-1 de sacarosa y agua de coco al 5%. Al inicio, la suspensión celular presentó coloración café oscuro y agregados celulares de tamaños irregulares, después de varios subcultivos se generó una suspensión celular de agregados de tamañon pequeño (<5 mm) con células libres (<250 µm) de color café claro. Posteriormente se caracterizó el cultivo realizando cinéticas de crecimiento y producción de metabolitos secundarios farmacológicamente activos, a través del registro de los pesos secos de las biomasas obtenidas a diferentes tiempos de cultivo y su análisis químico de dichas biomasas. El crecimiento de la suspensión celular de T. americana var. mexicana se caracterizó con base en los parámetros cinéticos como Ic (4.8 ± 0.88), td (6.60 ± 0.78 d), µmáx (0.107 ± 0.01 d-1 ), Bmáx (17.86 gPS L -1 ) y rendimiento Y (0.637 ± 0.067 gPS gsacarosa -1 ). La biomasa producida en cada cinética se extrajo con metanol y en estos extractos se identificó por CLAR la presencia de 3-O-β-D-glucósido de quercetina (ansiolítico) y de escopoletina (antiinflamatorio), los datos de tiempos de retención y espectros de absorción se compararon con los de estándares comerciales. La cuantificación de los compuestos activos se realizó por el método del estándar externo.
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