Producción de Quitina desacetilasa fúngicas y su aplicación en la desacetilación de Biopolímeros Público Deposited
Colletotrichum gloeosporioides es un hongo fitopatógeno causante de la antracnosis de frutos en climas tropicales y subtropicales, mucho se ha estudiado sobre la patogénesis de este hongo con el fin de disminuir la infección hacia los cultivos, son pocos los reportes que actualmente existen sobre su producción de enzimas quitina desacetilasa (CDA). Estas enzimas son requeridas para su actividad patogénica y para el desarrollo del mismo. En virtud de lo anterior, en esta tesis de doctorado se estudiaron diversos factores que afectan la producción de dichas proteínas, como lo son, la fuente de carbono y nitrógeno, inductores, el pH y el sistema de producción enzimática empleado. También se determinó la actividad de las quitinas desacetilasas después de ser purificadas sobre diferentes sustratos , tales como quitosano reacetilados con un DA del 57 y 69 %, una quitina modificada químicamente , N - acetil glucosamina y ácido hialurónico. El tipo de la fuente de nitrógeno y de carbono influyeron significativamente sobre la producción de CDA , mostrando mayores actividades cuando se utilizó glucosa y ácido glutámico, de la misma manera el uso del ácido abscísico como inductor de la actividad favoreció la producción de estas enzimas obteniendo 9.5 veces (1.05 U mg proteína - 1) más con respecto al control (0.11 U mg proteína - 1) , posteriormente se observó que el pH del medio de cultivo afectó de manera significativa la producción de la enzima mostrando mayores actividades a pH ácido que a pH neutro. Es importante resaltar que estas altas producciones de enzima se vieron acompañadas de una reducción de la fase lag durante el desarrollo del hongo, observándose que el proceso de germinación y la elongación de las hifas de C. gloeos porioides se presentó a menores tiempos en comparación del control (12 h) . La modif icación al sistema de producción enzimática , pasando de un sistema cerrado a un sistema por lote alimentado incrementó la producción de la CDA. El aumento en la producción de estás enzimas modificó la composición de las pared es celulares de l os hongo s como fue evidente después de extraer quitina y analizar las fracciones acetiladas (FA). Las quitinas desacetilasas producidas por C. gloeosporioides fueron capaces de desacetilar la quitina cuando se añadió ácido abscísico al medio de cultivo (FA =0.79) mientras que el control mantuvo una alta FA de 0.90. Por otra parte, la purificación de la enzima se llevó a cabo precipitando con sulfato de amonio a un 80 % de saturación, cromatografía de exclusión molecular y por intercambio aniónico , obteniendo una actividad específica de 2.9 U mg de proteína - 1 (8.5 veces más que lo obtenido en el extracto crudo). La enzima purificada presentó un peso molecular aparente de 50 kDa , detectándose actividad sobre etilenglicol quitina en el zimograma realizado. La temperatura óptima fue de 37 °C y el pH óptimo fue de 3, cuando la etilenglicol quitina y un quitosano reacetilado con DA=69 % fueron utilizados como sustratos, presentando una concentración óptima para cada sustrato de 12.5 y 15 mg mL - 1 respectivamente. La CDA presentó actividad significativa sobre quitosanos reacetilados y sobre una quitina tratada previamente con la técnica despresurizac ión rápida con freón en estado supercrítico y fibrilación, los productos obtenidos de la reacción fueron analizados por resonancia magnética nuclear (H RMN ) y por cromatografía de exclusión molecular . Los resultados indican que la actividad de la enzima tuvo un efecto importan te sobre el grado de acetilación (DA) e n los productos de reacción , disminuyendo en un 36.5 % el grado de acetilación del quitosano reacetilado al 69 % y un 17 % sobre la quitina, mientras que los pesos moleculares de las muestras disminuyeron de manera no significativa.
Colletotrichum gloeosporioides is a phytopathogenic fungus that causes anthracnose in fruit of tropical and subtropical climates; the pathogenesis of this fungus has been extensively studied in order to decrease infection to crops, however there are scarce reports on the production of chitin deacetylase enzymes . These enzymes play an important role in phytopathogenic process . Therefore , in this dissertation various factors affecting the production of these proteins were studied, such as the source of carbon and nitrogen, in ducer s, pH and the submerged culture system. The hydrolytic activity of chitin deacetylase after purifi cation on diff erent substrates such as rea cetylated chitosan with a DA of 57 and 69 %, chitin, ethylene glycol chitin, N - acetyl glucosamine and hyaluronic acid was determined The nitrogen a nd carbon source significantly affected the production of chitin deacetylase, showing the highe st activity when glutamic acid and glucose w ere employed as nitrogen and carbon source respectively. As well, a beneficial effect was observed with addition of abscisic acid as an inducer of activity , which favored the production of t hese enzymes increasing up to 9.5 - fold more activity (1.05 U mg protein - 1 ) than the control (0.11 U mg protein - 1 ). In addition, the pH of the culture medium displayed significantly e ffect on the production of the enzyme showing higher activity at acid ic pH than neutral pH. Importantly, these high yields of enzyme were accompanied by a reduction of lag phase during development of the fungus, noting that the process of germination and hyphal elongation of C. gloeosporioides showed shorter time compared t ha n control . The change of enzyme production culture , from a closed to a fed - batch system , significantly increased the production of chitin deacetylase. The increase in production of chitin deacetylases might have changed the chitin in fungal cell wall , therefore a f ter extraction a cetylation fraction was determined. NMR analyz es of the s e biopolymer s produced from biomasses obtained in systems with enhanced production of chitin deacetylase s, lower acetylated fraction of chitin was detected when abscisic acid was added to the culture medium ( F A = 0.79) than control ( F A = 0.90). Once the production conditions were selected, purification of the enzyme was carried out by salting out ( ammonium sulfate 80 % saturation ) , followed by size exclusion and anionic exchange, obta ining 8.5 - fold higher activity than crude extract. The purified enzyme showed an apparent molecular weight of 5 0 kDa , its activity was dete cted o n zymmograms with ethylene glycol chitin . T he optimal temperature and pH were determined a s 37 ° C and 3 , respectively with ethylene glycol chitin and chitosan reacetylated with DA=69 % as substrates. In a range of substrate concentration, the highest activity was detected at 12.5 and 15 mg mL - 1 for ethylene glycol chitin and reacetylated chitosan (DA=60%), respectively. Chitin deacetylase present ed significant ac tivity on reacetylated chitosans and chitin ( previously treated wit h rapid depressurization from supercritical 1,1,1,2 - tetrafluoroethane and fibrillat ion ) , the products obtained from the reaction were analyzed by nuclear magnetic resonance ( H NMR) and gel permeation chromatography . The results indicate d that the enzyme activity had a significant effect on the degree of acetylation of the reaction products, reducing 36.5 % degree of acetylation of r eacetylated chitosan at 69 % and 17 % of chitin , while the decreases of molecular weight of the samples were not significantly different.
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