Evaluación de la actividad superficial de fracciones de proteínas de semillas de chía (Salvia hispánica L.) con distinta hidrofobicidad Público Deposited
The objective of this research was to characterize the main protein fractions contain in chia seeds (Salvia hispanica) in order to analyze their performance as agents with surface activity. The techniques used can be grouped, according to their purpose, into 3 different types, which were carried out in chronological order according to the following: 1) Physical-chemical characterization of chia seeds, 2) Extraction and general characterization of chia proteins fractions and 3) Evaluation of their surface activity. The results obtained in the laboratory showed that chia seeds have great potential for use in the biotechnology sector due to a large number of macromolecules present, mainly carbohydrates, lipids, and proteins. The content of the latter group of compounds is noteworthy since it was higher than that commonly found within the higher consumed cereals, accounting for almost 20% of the total dry weight. On the other hand, carbohydrates were the main compound found in the seeds, with 39.3% of the total, whereas the oil content was 32.6%. Once verified that proteins content in chia seeds was adequate to carry out the extraction procedure, we proceeded to the fractionation of the bulk, using solubility in different solvents as criterion for fractionation. In this sense, 4 main fractions were obtained: albumins (soluble in water), globulins (soluble in 1 M NaCl), prolamins (soluble in 70% ethanol) and glutelins (soluble in 0.2% NaOH). Globulins was the fraction with the highest yield with 53.6% of the total, followed by the albumins with 17.9%; while glutelins and prolamins, displayed contents of 14.3% and 11.96%, respectively. Each fraction was subjected to a series of general tests, in order to characterize basic aspects of each group. First, the analysis of molecular weights by static light scattering revealed that these proteins have molecular masses distributed over a wide range, albumins being the highest weight fraction (954 kDa), while globulins, with 62.1 kDa, they were the sample with the lowest value found. A significant fact of this test is that the present work is a pioneer in the analysis of proteins derived from chia by this technique. On the other hand, the analysis of the secondary structure for each fraction revealed that in all samples there is a significant preponderance of flexible type configurations (α-helix and random coil), which together accounted for more than 60% of the total. Several authors have previously highlighted the importance of this type of arrangement in the stabilization of dispersed systems due to their potential to be placed in interfaces, compared with structures of the β-sheet type. Thermodynamic characterization carried out by using differential scanning calorimetry (DSC) allowed establishing valuable conclusions regarding the samples. In the first place, the thermograms analysis facilitated the visualization of different subtypes of proteins within each of the main families (albumins, globulins, prolamins, and glutelins), all of them displaying denaturation temperatures above 75 ° C, where a maximum of 122.9 °C was shown by a globulin subtype. In addition, all of them showed denaturation enthalpies superior to those reported in previous studies. This fact opens the door to multiple applications for these proteins due to the growing interest in developing materials capable of withstanding high temperatures during processing without losing their functional qualities. In the last stage of the general characterization, the variation of water solubility as a function of pH in the 4 types of isolated proteins was analyzed. All the samples displayed similar solubility profiles, with maximum values at alkaline pH's, while the lowest values were observed around pH 3, due, most likely, to the proximity to the isoelectric point. The maximum solubility of these samples was achieved at pH 12, where around 85% of globulins were solubilized, while glutelins reached a limit of 70%. The final phase of this investigation was to examine some of the main parameters that influence the surface activity of proteins, in order to use them as surface agents in the stabilization of oil/water type emulsified systems, as well in the formation and/or stabilization of foams. The hydrophobicity profile of each fraction was examined by hydrophobic interaction chromatography (HIC), a method that, like the DSC technique, allowed the visualization of different subtypes of each protein family. As expected, albumins and globulins had a higher proportion of hydrophilic subtypes, whereas in prolamins and glutelins predominates those of a hydrophobic nature. However, the 4 fractions showed an equilibrium in their level of hydrophobicity, a fact that significantly favors surface activity. On the other hand, it was found that the capacity of water retention is not necessarily linked to the solubility profiles, since the samples of predominant hydrophobic profile showed high values in this parameter, which is clear evidence that both phenomena, despite if they are influenced by similar phenomena, they are complex functions of different parameters. Through the analysis of the zeta potential, it was found that the albumins, prolamins, and glutelins exhibit predominantly negative surface charge over a wide pH range, in fact, there is a clear tendency of the increase in this as the environment becomes more alkaline, reaching maximum values between -25 and -30 mV for glutelins. On the other hand, this tendency is very weak in the case of globulins, which did not exceed -5 mV in the pH range evaluated. The isoelectric points determined in this test agree with the minimum values of solubility found around pH 3. The presence of ionizable groups on the surface of the proteins significantly influences the performance of proteins in the manufacturing processes of emulsions and foams since electrostatic repulsion is key to the stability of the dispersed phase, in addition to that it has been proposed that those proteins near their isoelectric point are capable of showing greater surface activity. One of the most important characterizations involved in studying the protein adsorption dynamics in water-air and water-oil interfaces. By monitoring the interfacial tension, it was verified that the 4 analyzed fractions decrease this parameter in a very short time. Likewise, the analysis of the data revealed that the global phenomenon is complex and consists mainly of 3 stages: a) diffusion from the bulk to the interface, b) adsorption and deployment at the interface and c) aggregation and rearrangement within the interfacial layer. The dynamic constants in each stage were calculated, verifying that those in which a hydrophilic surface predominated showed better performance in a water-air system, while those in which the hydrophobic character prevailed worked better in the water-oil interface.
El objetivo de esta investigación consistió en caracterizar las principales fracciones proteicas presentes en las semillas de chia (Salvia hispanica) con el fin de analizar su desempeño como agentes con actividad superficial. Las técnicas empleadas pueden agruparse, según su propósito, en 3 distintos tipos, mismas que se realizaron en orden cronológico de acuerdo con lo siguiente: 1) caracterización fisicoquímica de las semillas de chía, 2) extracción y caracterización general de las fracciones de proteína de chía y 3) evaluación de su actividad superficial. Los resultados obtenidos en el laboratorio mostraron que las semillas de chía poseen gran potencial para su uso en el sector biotecnológico debido a la importante cantidad de macromoléculas presentes, principalmente carbohidratos, lípidos y proteínas. El contenido de este último grupo de compuestos es de destacar, ya que fue superior a lo tradicionalmente encontrado en los cereales de mayor consumo (como el maíz, trigo, etc.), con el 20% del total del peso seco. Por su parte, los carbohidratos fueron el principal compuesto hallado en las semillas, con el 39.3% del total, mientras que el contenido de aceite se ubicó en 32.6%. Una vez comprobado que la cantidad de proteínas presentes en las semillas era adecuada en términos de rendimiento para llevar a cabo la extracción, se procedió al fraccionamiento del bulk usando como criterio la solubilidad de cada fracción en distintos solventes. A partir de lo anterior, se obtuvieron 4 fracciones principales: albúminas (solubles en agua), globulinas (solubles en NaCl 1 M), prolaminas (solubles en etanol al 70% v/v) y glutelinas (solubles en NaOH 0.2% v/v). La fracción con el mayor rendimiento másico fueron las globulinas, con 53.6% del total, seguido de las albúminas con 17.9%; las glutelinas y prolaminas, por su parte, mostraron contenidos de 14.3% y 11.96%, respectivamente. Cada fracción fue sometida a una serie de pruebas generales con el fin de caracterizar aspectos básicos de cada grupo. En primer lugar, el análisis del peso molecular mediante dispersión estática de luz reveló que las proteínas presentan masas moleculares distribuidas en un intervalo amplio, siendo las albúminas la fracción de mayor peso (954 kDa), mientras que las globulinas, con 62.1 kDa, fueron la muestra con el menor valor hallado. Un hecho significativo de esta prueba es que el presente trabajo es pionero en el análisis de proteínas derivadas de chía mediante esta técnica. El análisis de la estructura secundaria para cada fracción reveló que en todas las muestras existe una preponderancia significativa de configuraciones de tipo flexible (como α-hélice y random coil o estructuras aleatorias), las cuales en conjunto sumaron más del 60% del total. Diversos autores han destacado previamente la importancia de este tipo de disposiciones en la estabilización de sistemas dispersos debido a su potencial para situarse en interfases, comparadas con estructuras del tipo hoja-β. La caracterización termodinámica mediante calorimetría diferencial de barrido (DSC) permitió establecer conclusiones valiosas respecto a las muestras. En primer lugar, el análisis de los termogramas facilitó la visualización de distintos subtipos de proteínas dentro de cada una de las familias principales (albúminas, globulinas, prolaminas y glutelinas), todas ellas teniendo temperaturas de desnaturalización por arriba de los 75 ºC, encontrando un máximo de 122.9 ºC para un subtipo de globulina. Además, todas presentaron entalpías de desnaturalización superiores a lo reportado en estudios previos. Este hecho abre la puerta a múltiples aplicaciones para estas proteínas debido al interés creciente de desarrollar materiales capaces de soportar temperaturas elevadas durante el procesamiento sin perder sus propiedades funcionales. En la última etapa de la caracterización general se analizó la variación de la solubilidad en agua como función del pH para los 4 tipos de proteínas aisladas. Todas las muestras presentaron perfiles de solubilidad similares, con valores máximos a pH´s alcalinos, mientras que los valores más bajos se observaron alrededor de pH 3, debido, muy probablemente, a la cercanía con el punto isoeléctrico. La solubilidad máxima de estas muestras se logró a pH 12, donde alrededor del 85% de globulinas se encontraban solubilizadas, mientras que las glutelinas alcanzaron un límite del 70%. La fase final de esta investigación consistió en examinar algunos de los principales parámetros que influyen en la actividad superficial de proteínas con la intención de analizar su potencial utilización como agentes estabilizantes de sistemas emulsificados, así como para la formación y/o estabilización de espumas. Se examinó el perfil de hidrofobicidad de cada fracción mediante cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC), método que, al igual que la técnica de DSC, permitió visualizar distintos subtipos de cada familia de proteínas. Como era de esperarse, las albúminas y globulinas presentaron una mayor proporción de subtipos hidrofílicos, mientras que en las prolaminas y glutelinas predominan aquellos de carácter hidrofóbico. No obstante, las 4 fracciones muestran un equilibrio en su nivel de hidrofobicidad, hecho que favorece significativamente la actividad superficial. Por su parte, se comprobó que la capacidad de retención de agua no forzosamente está ligada a los perfiles de solubilidad, ya que las muestras de perfil predominante hidrofóbico mostraron valores elevados en este parámetro, lo cual es evidencia clara de que ambos fenómenos, a pesar de estar influenciados por eventos similares, son funciones complejas de distintas variables A través del análisis del potencial zeta se comprobó que las albúminas, prolaminas y glutelinas exhiben predominantemente carga superficial negativa en un amplio intervalo de pH, de hecho, existe una tendencia clara del aumento de ésta conforme se hace más alcalino el medio, alcanzando valores máximos entre -25 y -30 mV para las glutelinas. Por otra parte, esta tendencia se muestra muy débil para el caso de las globulinas, las cuales no superaron los -5 mV en el intervalo de pH evaluado. Los puntos isoeléctricos determinados en este test concuerdan con los valores mínimos de solubilidad hallados alrededor de pH 3. La presencia de grupos ionizables en la superficie de las proteínas influye de manera significativa en el desempeño que exhibirán en los procesos de fabricación de emulsiones y espumas, dado que la repulsión electrostática es 8 clave para la estabilidad de la fase dispersa, además de que se ha propuesto que aquellas proteínas cercanas a su punto isoeléctrico son capaces de mostrar mayor actividad superficial. Una de las caracterizaciones más importantes consistió en estudiar la dinámica de adsorción de las proteínas en interfaces agua-aire y agua-aceite. Mediante el monitoreo de la tensión interfacial se comprobó que las 4 fracciones analizadas disminuyen de forma notable este parámetro en tiempos muy cortos. Así mismo, el análisis de los datos reveló que el fenómeno global es complejo y consta principalmente de 3 etapas: a) difusión desde el bulk hacia la interfase, b) adsorción y despliegue en la interfase y c) agregación y reacomodo dentro de la capa interfacial. Se calcularon las constantes dinámicas en cada etapa, en donde aquellas en las que predominó una superficie hidrofílica mostraron mejor desempeño en un sistema agua-aire, mientras que aquellas en las que el carácter hidrofóbico prevalecía funcionaron de mejor manera en la interfase agua-aceite.
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