Síntesis de oligosacáridos fucosilados con actividad biológica empleando fucosidasa de Thermotoga maritima Public Deposited
Los oligosacáridos fucosilados, como la 2′-fucosil-lactosa en la leche humana, tienen importantes funciones biológicas como prebióticos, previniendo infecciones y como inmunomoduladores. En este trabajo, oligosacáridos fucosilados (FUCOS) fueron sintetizados por medio de una reacción enzimática de transfucosilación catalizada por la αL-fucosidasa recombinante de Thermotoga maritima, empleando 4-nitrofenil-α-Lfucopiranósido (pNP-Fuc) como sustrato donador y lactosa como sustrato aceptor. Los tópicos abordados en este trabajo fueron el estudio de algunos factores que influyen en los rendimientos de la síntesis, la purificación e identidad de los compuestos sintetizados y finalmente la actividad biológica de los compuestos sintetizados mediante la estimulación de células del sistema inmune para la producción de citocinas. Con respecto al efecto de la concentración de los sustratos, se encontró que conforme la concentración del sustrato aceptor incrementaba, la concentración y velocidad de síntesis de los FUCOS también incrementaron, y la concentración más alta obtenida fue 0.883 mM (rendimiento 25.2 %) cuando se usó la concentración de lactosa mayor (584 mM). En contraste, la concentración del sustrato donador no tuvo efecto sobre la síntesis. Adicionalmente, la proporción molar donador/aceptor (D/A) más baja tuvo la mayor síntesis, de manera que, a una proporción molar de 0.001, se obtuvo una concentración de FUCOS de 0.286 mM (rendimiento 32.5 %). Por otra parte, la influencia de CaCl2 y NaCl en la actividad hidrolítica de la α-L-fucosidasa de T. maritima también fue evaluada, y mostró un máximo incremento del 67 % en presencia de NaCl 0.8 M con una actividad de agua (aw) de 0.9672, y de 138 % en presencia de CaCl2 1.1 M (aw 0.9581). Además, la actividad hidrolítica fue mayor cuando se empleó CaCl2 comparada con NaCl a una aw de 0.8956, 0.9581 y 0.9672. Asimismo, el efecto de CaCl2 en la síntesis de FUCOS empleando pNP-Fuc como sustrato donador y lactosa como aceptor, fue estudiado, y aumentaron los rendimientos de síntesis duplicando y triplicándolos a concentraciones de lactosa 146 y 58 mM respectivamente. Lo anterior significa que la concentración del sustrato aceptor, una baja proporción D/A, el efecto activador del CaCl2 y la disminución de la aw tuvieron un efecto sinérgico favoreciendo la síntesis de FUCOS. Adicionalmente, el método de purificación de FUCOS que presentó los mejores resultados fue por medio de exclusión molecular, con una recuperación del 51.5 % y pureza de 97 %. Por medio de la espectrometría de masas–desorción/ionización láser asistida por matriz – tiempo de vuelo (MALDI-TOF MS), se demostró que el principal oligosacárido sintetizado corresponde a un trisacárido fucosilado, y un análisis de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) del compuesto hidrolizado lo confirmó como fucosil-lactosa. Además, el efecto de los FUCOS purificados sobre la estimulación de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) fue evaluado midiendo la producción de interleucina-10 (IL-10, una citocina antiinflamatoria) y el factor de necrosis tumoral-α (TNF-α, una citocina proinflamatoria). Se encontró que la estimulación de PBMC con FUCOS previo a una estimulación con lipopolisacárido (un estímulo positivo), incrementa la producción de IL-10 en un 50 %. Por otro lado, el efecto de los FUCOS sobre la producción de TNF-α podría depender de características particulares de cada individuo. En conclusión, los FUCOS sintetizados por medio de transfucosilación empleando pNP-Fuc como sustrato donador, lactosa como sustrato aceptor y α-L-fucosidasa recombinante de T. maritima mostraron una estructura similar a los FUCOS presentes en la leche humana y una actividad inmunomoduladora similar.
Fucosylated oligosaccharides, such as 2′-fucosyllactose in human milk, have important biological functions such as prebiotics, preventing infection and immunomodulators. In this work, fucosylated oligosaccharides (FUCOS) were synthesized by means of an enzymatic reaction of transfucosylation catalyzed by a recombinant α-L-fucosidase from Thermotoga maritima, employing 4-nitrophenyl-α-L-fucopyranoside (pNP-Fuc) as a donor substrate and lactose as an acceptor substrate. The topics addressed in this work were the study of some factors that influence the yields of synthesis, the purification and identity of synthesized compounds and finally the biological activity of synthesized compounds towards stimulation of immune cells to produce cytokines. Regarding the effect of concentrations of substrates, it was found that as the concentration of the acceptor substrate increased, the concentration and synthesis rate of the FUCOS also increased, and the highest concentration obtained was 0.883 mM (25.2 % yield) when using the higher lactose concentration (584 mM). In contrast, concentration of donor substrate had no effect on synthesis. Furthermore, the lower donor/acceptor (D/A) ratio had the highest synthesis, so at the molar ratio of 0.001, a concentration of 0.286 mM of FUCOS was obtained (32.5 % yield). On the other hand, the influence of CaCl2 and NaCl in the hydrolytic activity of α-L-fucosidase from T. maritima was also evaluated, and hydrolytic activity displayed a maximum increase of 67 % in presence of NaCl 0.8 M with water activity (aw) of 0.9672 and of 138 % in presence of CaCl2 1.1 M (aw 0.9581). In addition, the hydrolytic activity was higher when using CaCl2 compared to NaCl at aw of 0.8956, 0.9581 and 0.9672. Moreover, the effect of CaCl2 in the synthesis of FUCOS by using 4-nitrophenyl-fucose as donor substrate and lactose as acceptor was studied, and improved the yield of synthesis duplicating and triplicating at lactose concentrations of 58 and 146 mM, respectively. The above means that acceptor substrate concentration, a low D/A ratio, the activating effect of CaCl2 and the decrement in aw had a synergistic effect favored the synthesis of FUCOS. Furthermore, the purification method of FUCOS that presented the best results was by means of molecular exclusion, with a recovery of 51.5 % and a purity of 97 %. Conducting a matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS), it was demonstrated that main synthesized oligosaccharide corresponded to a fucosylated trisaccharide, and high performance liquid chromatography (HPLC) of the hydrolyzed compound confirmed it was fucosyllactose. In addition, the effect of purified FUCOS on the simulation of peripherical blood mononuclear cells (PBMC) was evaluated by measuring the production of interleukin10 (IL-10, an anti-inflammatory cytokine) and tumoral necrosis factor- α (TNF-α, a proinflammatory cytokine). It was found that the stimulation of PBMC with FUCOS before a stimulation with lipopolysaccharide (a positive stimulus), triggers the production of IL-10 by 50 %. On the other hand, the effect of FUCOS on TNF-α production could depend on particular characteristics of each individual. In conclusion, FUCOS synthesized by means of transfucosylation employing pNP-Fuc as a donor substrate, lactose as an acceptor substrate and recombinant α-L-fucosidase from T. maritima displayed a structure similar to FUCOS present in human milk and possess a similar immunomodulating activity.
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