Síntesis de oligosacáridos fucosilados con actividad biológica empleando fucosidasa de Thermotoga maritima Público Deposited

Los oligosacáridos fucosilados, como la 2′-fucosil-lactosa en la leche humana, tienen importantes funciones biológicas como prebióticos, previniendo infecciones y como inmunomoduladores. En este trabajo, oligosacáridos fucosilados (FUCOS) fueron sintetizados por medio de una reacción enzimática de transfucosilación catalizada por la αL-fucosidasa recombinante de Thermotoga maritima, empleando 4-nitrofenil-α-Lfucopiranósido (pNP-Fuc) como sustrato donador y lactosa como sustrato aceptor. Los tópicos abordados en este trabajo fueron el estudio de algunos factores que influyen en los rendimientos de la síntesis, la purificación e identidad de los compuestos sintetizados y finalmente la actividad biológica de los compuestos sintetizados mediante la estimulación de células del sistema inmune para la producción de citocinas. Con respecto al efecto de la concentración de los sustratos, se encontró que conforme la concentración del sustrato aceptor incrementaba, la concentración y velocidad de síntesis de los FUCOS también incrementaron, y la concentración más alta obtenida fue 0.883 mM (rendimiento 25.2 %) cuando se usó la concentración de lactosa mayor (584 mM). En contraste, la concentración del sustrato donador no tuvo efecto sobre la síntesis. Adicionalmente, la proporción molar donador/aceptor (D/A) más baja tuvo la mayor síntesis, de manera que, a una proporción molar de 0.001, se obtuvo una concentración de FUCOS de 0.286 mM (rendimiento 32.5 %). Por otra parte, la influencia de CaCl2 y NaCl en la actividad hidrolítica de la α-L-fucosidasa de T. maritima también fue evaluada, y mostró un máximo incremento del 67 % en presencia de NaCl 0.8 M con una actividad de agua (aw) de 0.9672, y de 138 % en presencia de CaCl2 1.1 M (aw 0.9581). Además, la actividad hidrolítica fue mayor cuando se empleó CaCl2 comparada con NaCl a una aw de 0.8956, 0.9581 y 0.9672.

Asimismo, el efecto de CaCl2 en la síntesis de FUCOS empleando pNP-Fuc como sustrato donador y lactosa como aceptor, fue estudiado, y aumentaron los rendimientos de síntesis duplicando y triplicándolos a concentraciones de lactosa 146 y 58 mM respectivamente. Lo anterior significa que la concentración del sustrato aceptor, una baja proporción D/A, el efecto activador del CaCl2 y la disminución de la aw tuvieron un efecto sinérgico favoreciendo la síntesis de FUCOS. Adicionalmente, el método de purificación de FUCOS que presentó los mejores resultados fue por medio de exclusión molecular, con una recuperación del 51.5 % y pureza de 97 %. Por medio de la espectrometría de masas–desorción/ionización láser asistida por matriz – tiempo de vuelo (MALDI-TOF MS), se demostró que el principal oligosacárido sintetizado corresponde a un trisacárido fucosilado, y un análisis de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) del compuesto hidrolizado lo confirmó como fucosil-lactosa. Además, el efecto de los FUCOS purificados sobre la estimulación de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) fue evaluado midiendo la producción de interleucina-10 (IL-10, una citocina antiinflamatoria) y el factor de necrosis tumoral-α (TNF-α, una citocina proinflamatoria). Se encontró que la estimulación de PBMC con FUCOS previo a una estimulación con lipopolisacárido (un estímulo positivo), incrementa la producción de IL-10 en un 50 %. Por otro lado, el efecto de los FUCOS sobre la producción de TNF-α podría depender de características particulares de cada individuo. En conclusión, los FUCOS sintetizados por medio de transfucosilación empleando pNP-Fuc como sustrato donador, lactosa como sustrato aceptor y α-L-fucosidasa recombinante de T. maritima mostraron una estructura similar a los FUCOS presentes en la leche humana y una actividad inmunomoduladora similar.

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  • 2018
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Última modificación: 09/07/2022
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