Estudio fisiológico de la nitrificación y oxidación del p-cresol en un consorcio nitrificante Pubblico Deposited
Un reactor nitrificante en continuo en estado estacionario sirvió como fuente de inóculo para realizar cultivos nitrificantes en lote y operar dos reactores de lotes secuenciados (SBR) nitrificantes. En ambos sistemas de estudio, se evaluó el efecto del p-cresol sobre el metabolismo de un consorcio nitrificante, así como la capacidad del lodo en oxidar el compuesto fenólico. En cultivos en lote, se observó el efecto inhibitorio de 25 mg C L-1 de p-cresol sobre la nitrificación a través de un descenso en las velocidades del proceso, siendo más afectada la amonio oxidación que la nitrito oxidación. Las velocidades específicas de consumo de amonio (qNH4) y producción de nitrato (qNO3) disminuyeron un 83 y 60%, respectivamente respecto a los cultivos control. Sin embargo, después de 48 h, los cultivos alcanzaron una eficiencia en el consumo de amonio (ENH4) de 96% ± 9 y un rendimiento en la producción de nitrato (YNO3) de 0.95 ± 0.06 g N-NO3- producido g-1 N- NH4+ consumido. Estos resultados indicaron que la nitrificación únicamente fue afectada en su velocidad ya que el nitrato siguió siendo el principal producto de la vía. El p-cresol fue totalmente consumido a las 2 h de cultivo, a una velocidad específica de 0.17 ± 0.06 mg C mg-1 proteína microbiana h-1. Se identificaron y cuantificaron dos intermediarios de la oxidación del p-cresol: el p-hidroxibenzaldehído (pOHDO) y el p- hidroxibenzoato (pOHTO). Ambos intermediarios desaparecieron del cultivo y de acuerdo con la concentración de carbono orgánico total a las 24 h, no hubo presencia de materia orgánica remanente en el cultivo. El bajo rendimiento de producción de biomasa (YBM = 0.15 ± 0.02 mg C-biomasa mg-1 C-p-cresol consumido) indicó que solamente el 15% del carbono de p-cresol consumido fue asimilado, sugiriendo que el p-cresol fue principalmente mineralizado. El consorcio nitrificante fue capaz de oxidar al p-cresol con la enzima amonio monooxigenasa (AMO) totalmente inhibida por aliltiourea, con la formación secuencial de los mismos intermediarios y en un patrón cinético muy similar a los cultivos sin aliltiourea. Esto sugirió que la AMO no estuvo involucrada en la oxidación del p-cresol y que la inhibición de la nitrificación, en particular de la amonio oxidación, no fue de tipo enzimática. Los resultados sugirieron que la microflora heterótrofa del consorcio nitrificante pudo haber sido involucrada en la oxidación de los compuestos orgánicos. Al adicionar pOHDO a los cultivos en lote, se encontró que las qNH4 y qNO3 disminuyeron en la misma proporción que cuando el p-cresol fue adicionado inicialmente. Además, la velocidad específica de consumo de pOHDO fue ocho veces menor que la velocidad específica de consumo de p-cresol, teniendo como consecuencia una acumulación de pOHDO en el cultivo. Los resultados anteriores sugieren que la oxidación del pOHDO fue el paso limitante en la mineralización del p-cresol por el consorcio nitrificante y que éste pudiera ser el verdadero responsable de la inhibición de la nitrificación. En el SBR, el consorcio nitrificante fue capaz de oxidar todas las concentraciones iniciales probadas de p-cresol (25-200 mg C L-1) y simultáneamente oxidar al amonio a nitrato con una actividad nitrificante estable, obteniéndose una ENH4 de 99.0% ± 0.5 y un YNO3 de 0.98 ± 0.07. El consorcio toleró la adición de p-cresol en el SBR a una velocidad de carga de hasta 400 mg C-p-cresol L-1 d-1 sin que se afectara su actividad nitrificante. El p-cresol fue transformado a pOHDO y pOHTO antes de ser mineralizado. Los resultados cinéticos demostraron que el SBR permitió un incremento en la capacidad metabólica del consorcio nitrificante para oxidar cada vez más rápidamente al p-cresol y sus intermediarios a través de los ciclos de operación. El pOHDO fue el más recalcitrante, ya que presentó una mayor acumulación en los cultivos del SBR. Aunque aumentó la velocidad de crecimiento del lodo al adicionar p-cresol en el SBR de 1.0 a 4.6 mg proteína microbiana L-1 ciclo-1, el rendimiento de biomasa se mantuvo bajo (0.04 ± 0.01 mg C-biomasa mg-1 C-p-cresol consumido). Esto muestra que, bajo las condiciones experimentales utilizadas (C/N baja, inóculo estable fisiológicamente, medio de cultivo), el proceso fue desasimilativo, limitando el crecimiento excesivo de biomasa. Estos resultados indican que el reactor de lotes secuenciados nitrificante puede ser una buena opción para eliminar simultáneamente amonio y compuestos inhibitorios o recalcitrantes del agua, tales como los derivados del fenol.
A continuous nitrifying reactor in steady-state was used as a source of inoculum for performing kinetics of nitrifying batch cultures and operating two nitrifying sequential batch reactors (SBR). In both sets of study, the effect of p-cresol on the metabolism of a nitrifying consortium and the capacity of the sludge to oxidize the phenolic compound were evaluated. In batch cultures, the inhibitory effect of p-cresol on nitrification was observed through a decrease in the velocities of the process, the ammonium oxidizing process being the most affected. At a p-cresol concentration of 25 mg C L-1, the specific rates of ammonium consumption (qNH4) and nitrate production (qNO3) decreased by 83 and 60%, respectively respect to the control cultures. However, after 48 h, ammonium consumption efficiency (ENH4) was 96% ± 9 while nitrate yield (YNO3) reached 0.95 ± 0.06 g NO3--N g-1 NH4+-N consumed. These results showed that the nitrifying metabolic pathway was only affected at the specific rate level being nitrate the main end product. p-Cresol was completely consumed after 2 h of culture at a specific rate of 0.17 ± 0.06 mg C mg-1 microbial protein h-1. p-Hydroxybenzaldehyde (pOHBD) and p- hydroxybenzoate (pOHBT) were identified and quantified as transient intermediates of p-cresol oxidation. Both intermediates were eliminated from the culture after 24 h. The total organic carbon concentration reached a value close to zero after 24 h, showing the absence of organic matter in the culture. The low biomass production yield (YBM = 0.15 ± 0.02 g biomass-C g-1 p-cresol-C consumed) indicated that only 15% of the consumed p-cresol carbon was assimilated, suggesting that p-cresol was mainly mineralized. The sludge showed the metabolic capacity to oxidize simultaneously p- cresol and ammonium with consumption efficiencies close to 100%, producing CO2 and NO3- as main final products. When allylthiourea was added into the culture as a selective inhibitor of the enzyme amonio monooxygenase (AMO), the nitrifying consortium was still able to oxidize p- cresol to the same intermediates and in a similar kinetic pattern as obtained withou the AMO inhibitor. This suggested that the AMO was not involved in the p-cresol oxidation and that the inhibition of nitrification, especially of the ammonium oxidation process, was not an enzymatic inhibition. Results suggested that the heterotrophic microflora of the nitrifying consortium might be involved in the oxidation of the organic compounds. When pOHBD was added to the nitrifying batch cultures, qNO3 and qNH4 decreased in the same ratio than when p-cresol was initially added. Furthermore, the specific velocity of pOHBD consumption was eight times lower than the specific p-cresol consumption rate, having as a consequence an accumulation of pOHBD and a rapid elimination of p-cresol from the culture. These results suggested that pOHBD could be the main responsible for nitrification inhibition. pOHBD oxidation was the rate limiting step in p-cresol mineralization by the nitrifying consortium. In the SBR, at all tested initial p-cresol concentrations (25-200 mg C L-1), the nitrifying sludge was able to oxidize simultaneously ammonium and p-cresol with a stable nitrifying activity, obtaining a ENH4 of 99.0% ± 0.5 and a YNO3 of 0.98 ± 0.07 for all cycles. Up to 400 mg C L-1 d-1 of p-cresol can be tolerated by the nitrifying sludge without affecting its activity. p-Cresol was first transformed to pOHBD and pOHBT, which were later completely mineralized. Kinetic results showed that the SBR system allowed an increase in the metabolic ability of the sludge to oxidize p-cresol and its intermediates as they were oxidized faster and faster throughout the cycles. p-Hydroxybenzaldehyde appeared to be the most recalcitrant in the culture as it showed the highest accumulation in the SBR cultures. Although the growth rate of the sludge increased from 1.0 to 4.6 mg microbial protein L-1 cycle-1 when p-cresol was added into the SBR, the biomass yield remained low (0.04 ± 0.01 mg biomass-C mg-1 p-cresol-C consumed). This shows that, under the experimental conditions used (low C/N value, physiologically stable inoculum, culture medium), the process was dissimilative, limiting an excess sludge formation. Results indicate that nitrifying SBR may be a good alternative to eliminate simultaneously ammonium and inhibitory or recalcitrant chemicals, such as phenolic compounds from wastewaters.
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