Detección de rupturas de doble cadena en el ADN por medio de la histona H2AX fosforilada en linfocitos de ratas desnutridas Público Deposited
La desnutrición calórico proteica (DCP) es un estado patológico caracterizado por la falta de aporte adecuado de nutrimentos acordes con las necesidades biológicas del organismo. Existen referencias alrededor de la relación desnutrición y daño al ADN. Son diversos los elementos capaces de inducir daño al material genético: estilo de vida, medicamentos, polimorfismos genéticos y medio ambiente se encuentran entre los principales. El objetivo de este trabajo fue determinar el efecto de la desnutrición calórico proteica sobre el daño al ADN en linfocitos de ratas lactantes. La desnutrición se indujo por el método de competencia de alimento durante la lactancia, aumentando el número de crías por madre. Se provocó daño al ADN, tratando las células con peróxido de hidrógeno (H2O2) 100 μM durante 1 h. Por lote, se obtuvieron muestras en presencia y ausencia del agente, teniendo finalmente 6 grupos. Para el reconocimiento de linfocitos T se utilizó anti-CD3 FITC. Para revelar la presencia de rupturas de doble cadena en el ADN de linfocitos, mediante la detección de la histona γ-H2AX se ocupó anti-H2AX fosforilada FITC; se identificó por citometría de flujo y microscopía confocal. Para confirmar que existe daño en el material genético, empleamos la cuantificación de p53, utilizando anticuerpo anti-p53 (pS37) y un segundo anticuerpo conjugado con PerCP/Cy5.5; esta proteína fue identificada por citometría de flujo. Para complementar los resultados obtenidos, se empleó la metodología de electroforesis unicelular en condiciones alcalinas (ensayo cometa). Con esta técnica, al someter el material genético a un campo eléctrico, se pueden detectar rompimientos de cadena doble o de cadena sencilla. La imagen que se obtiene es semejante a la de un cometa en el que la cabeza es el nucleoide y el ADN fragmentado es la estela, cuya longitud refleja la cantidad de daño. El porcentaje de linfocitos que expresaron γ-H2AX fue significativamente mayor en los grupos de ratas desnutridas de 2º y 3er grado en presencia y ausencia de H2O2. El aumento en el grupo DN2o fue de 4 veces y de 2.9 veces para DN2oH2O2; para el grupo DN3er fue de 7.94 veces y el grupo de 3er grado en presencia de peróxido tuvo un incremento de 16.1 veces en comparación con el lote testigo. En el caso de p53 (que responde a daños celulares), los datos muestran un incremento significativo de 1.25 veces en el grupo DN2o y de 1.5 en BNH2O2 y un decremento significativo en los grupos de ratas desnutridas de 3er grado en presencia (2.9 veces) y ausencia de H2O2 (1.5 veces) con respecto a los animales BN. El análisis por microscopía confocal indicó un incremento significativo en la intensidad de fluorescencia solo en el grupo DN3erH2O2 comparado con el grupo BN de 27.3 veces. El ensayo cometa mostró un aumento considerable del número de nucleoides con migración clasificada como alta en los grupos de ratas con desnutrición de 2º y 3er grado en presencia y ausencia de H2O2, siendo mayor en los grupos con desnutrición grave Las lesiones observadas en el material genético, pueden deberse a la insuficiencia de varios nutrimentos necesarios para la síntesis de proteínas relacionadas con la integridad del ADN o esenciales para los mecanismos de reparación del mismo y/o a la falta de disponibilidad de las moléculas necesarias para proteger a las células. Los resultados obtenidos sugieren que la desnutrición provoca rupturas de doble cadena en el ADN e induce una disminución considerable en la capacidad celular para repararlas, estas pueden ser detectadas con alta sensibilidad evaluando la expresión de la histona γ-H2AX.
The protein calorie malnutrition (DCP) is a condition characterized by a lack of adequate supply of nutrients consistent with the biological needs of the organism. There are references about malnutrition and related DNA damage. Various elements are capable of inducing damage to genetic material: lifestyle, medications, genetic polymorphisms and environment are among the principal. The aim of this study was to determine the effect of protein calorie malnutrition on DNA damage in lymphocytes of lactating rats. Malnutrition was induced by the method of competition for food during lactation, increasing the number of offspring per mother. Damage was caused to the DNA, treating the cells with hydrogen peroxide (H2O2) 100 uM for 1 h. Batch, samples in the presence and absence of the agent is obtained, finally having 6 groups. For T cell recognition of anti-CD3 PE was used. To reveal the presence of double-stranded breaks in the DNA of cells, by detecting γH2AX histone dealt anti-H2AX FITC phosphorylated; were identified by flow cytometry and confocal microscopy. To confirm that there is damage to the genetic material, we used p53 quantification using anti-p53 antibody (pS37) and a second antibody conjugated to PerCP / Cy5.5; this protein was identified by flow cytometry. To complement these results, the methodology unicellular electrophoresis under alkaline conditions (comet assay) was used. With this technique, the genetic material subjected to an electric field, can detect breaks in double-stranded or single-stranded. The image obtained is similar to that of a comet in which the head is the nucleoid and fragmented DNA is the stele, which reflects the amount of damage. The percentage of lymphocytes expressing γ-H2AX was significantly higher in the groups of rats undernourished 2nd and 3rd grade in the presence and absence of H2O2. The increase in DN2o group was 4 times and 2.9 times for DN2ndH2O2; DN3rd for the group was 7.94 times and the group of 3rd grade in the presence of peroxide was increased 16.1 fold compared to the control batch. In the case of p53 (responding to cell damage), the data show a significant increase of 1.25 times in the DN2o group and 1.5 in BNH2O2 and a significant decrease in the groups of rats undernourished 3rd grade in the presence (2.9 times) and absence of H2O2 (1.5 fold) relative to BN animals. Confocal microscopy analysis indicated a significant increase in fluorescence intensity only in the group DN3rdH2O2 compared with BN group to 27.3 times. The comet assay showed a significant increase in the number of nucleoids with migration classified as high in the groups of rats undernourished 2nd and 3rd grade in the presence and absence of H2O2, being higher in the group with severe malnutrition. The lesions observed in the genetic material, may be due to the failure of various nutrients necessary for the synthesis of proteins related to DNA integrity or essential to the repair mechanisms thereof and/or the unavailability of the necessary molecules to protect cells. The results suggest that malnutrition causes double strand breaks in DNA and induces a significant decrease in cell capacity for repair, these can be detected with high sensitivity by evaluating the expression of histone γ-H2AX.
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