Estudio de la producción de quitinasas, proteasas e hidrofobinas de Lecanicillium lecanii en cultivos líquido y sólido utilizando diversas fuentes de carbono Público Deposited

Los hongos entomopatógenos producen diversas enzimas durante su proceso de patogénesis, entre ellas proteasas y quitinasas, así como hidrofobinas que permiten su adherencia al huésped, de las cuales se ha reportado que factores extrínsecos afectan su producción (St. Leger y col, 1986 y 1998). Sin embargo, poco se sabe de su producción por hongos como Lecanicillium lecanii, el cual es un hongo entomopatógeno utilizado como bioinsecticida en agricultura y horticultura a nivel comercial. El objetivo del estudio fue evaluar el efecto producido por el tipo de cultivo; en medio sólido (SSC) utilizando poliuretano como soporte, y en cultivo sumergido (SmC), y la fuente de carbono, en la producción quitinolítica, proteolítica y de hidrofobinas por L. lecanii. Éste hongo fue cultivado en SSC, y SmC, como fuentes de carbono se utilizaron: fructosa (F), fructosa con quitina (FQ), sacarosa con quitina (SaQ) y quitina (Q). La mayor producción de Nacetilhexosaminidasa (Nhasa) se obtuvo utilizando quitina coloidal como fuente de carbono a las 72 h en ambos cultivos. En SSCQ la producción de Nhasa (17.7 U/g sustrato inicial) fue mayor que en SmCQ (1.3 U/g sustrato inicial). Se observó que en SmC la producción de proteasas básicas (6.9 U/µg de proteína) y ácidas (6.3 U/µg de proteína) fue similar en presencia de quitina, mientras que en cultivos con otras fuentes de carbono se favoreció hasta 10 veces más la producción de proteasas ácidas que las básicas. Asimismo, en SSCQ la producción de proteasas (ácidas: 1.6 U/µg de proteína y básicas: 1 U/µg de proteína) fue hasta 6 veces menor en comparación con el SmCQ, lo que repercutió en los productos del cultivo susceptibles de ser hidrolizados por proteasas. La producción de hidrofobinas fue 10 veces mayor en SSC que en SmC. Además, el extracto de hidrofobinas de SSCQ mostró mayor actividad y redujo la hidrofobicidad del teflón hasta en 50%, mientras que las hidrofobinas extraídas de SmCF sólo lo hicieron en un 8 % (sin encontrarse diferencia significativa con el teflón usado como control). En ambos casos, las proteínas mostraron una masa molecular (Mr) de 7 kDa. Los zimogramas mostraron bandas con actividad quitinolítica de masas moleculares, desde 9 hasta 111 kDa. Se determinó la presencia de endoquitinasas, exoquitinasas y N-acetilhexosaminidasas en la mayoría de los tratamientos. Sólo en el cultivo SmC con la adición de fructosa y quitina coloidal mostraron proteínas con actividad quitobiasa. Estos resultados proporcionan información de los efectos del tipo de cultivo y fuentes de carbono en la producción de proteasas, quitinasas e hidrofobinas de L. lecanii, las cuales son productos de gran importancia debido a sus posibles aplicaciones. Es importante señalar que las hidrofobinas se produjeron en altos niveles en condiciones favorables para la inducción de quitinasas como la quitina coloidal y cultivo sólido, lo que sugiere que podrían estar relacionadas con el mecanismo de la patogénesis de los hongos, por lo que se debe realizar mayor investigación.

Entomopathogenic fungi produce various enzymes during the process of pathogenesis, including proteases and chitinases, as well as allowing hydrophobins its adherence to the host, which has been reported that extrinsic factors affecting its production (St. Leger et al, 1986 y 1998 ). However, there are not studies about their production by fungi such as Lecanicillium lecanii, an entomopathogenic fungus which is used as bio-insecticide in agriculture and horticulture on a commercial level. The aim of this study was the evaluation of the effect of culture type; on solid media (SSC) using polyurethane as support, and on media submerged (SmC), and the carbon sources, in the production of chitinolytic enzymes and hydrophobins of Lecanicillium lecanii. This fungus was grown on SSC media and SmC, as carbon sources were used: fructose (F), fructose with chitin (CF), sucrose with chitin (SaQ) and chitin (Q). Increased production of Nacetylhexosaminidase (Nhasa) was obtained using colloidal chitin at 72 h in SmC and SSC cultures. The Nhasa production in SSCQ (17.7 U/g initial substrate) was higher than the culture SmCQ (1.3 U/g initial substrate). The basic (6.9 U/µg protein) and acid (6.3 U/µg protein) proteases production was similar in presence of chitin, while in cultures with others carbon sources, the acid protease production was 10-fold higher than basic proteases. The protease production (acid: 1.6 U/µg protein y basic: 1 U/µg protein) was 6-fold lower in solid culture than in SmC, which affects the production of other proteins since might be hydrolyzed by the proteases. Hydrophobins production was 10-fold higher in SSC cultivation than in SmC. In addition, the extract of hydrophobins of SSCQ showed higher activity on surface due to the reduction up to 50% of the hydrophobicity of teflon, whereas hydrophobins found in SmCF reduces only 8% without significant difference with teflon. The molecular mass (Mr) of these proteins were determined ca. 7 kDa. The zymograms showed bands with chitinolytic activity with molecular mass, from 9 to 111 kDa. We determined the presence of endochitinases, exochitinases and N-acetylhexosaminidase in most treatments. Only SmC culture with added fructose and colloidal chitin showed bands chitobiase activity. These results provide information of the effects of culture type and carbon sources on production of proteases, chitinases and hydrophobins of L. lecanii, which are products of great importance due to their potential applications. It is important to note that hydrophobins were produced at high levels under favorable conditions for the induction of chitinases such as colloidal chitin and solid culture that suggest a relationship that might be related to the fungi mechanism of pathogenesis, thus more research should be performed.

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  • 2009
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