Saccharomyces cerevisiae triosephosphate isomerase (yTIM) is a dimeric protein comprised by two identical monomers of 248 residues each. This enzyme shows noncoincident unfolding and refolding transitions (hysteresis) in temperature scans, a phenomenon indicative of the slow forward and backward reactions of the native-unfolded process. Thermal unfolding scans suggest that no stable intermediates appear in the unfolding of yTIM. However, reported evidence points to the presence of residual structure in the denatured monomer at high temperature. In this work, it was found that thermally-denatured yTIM displays a clear trend to form aggregation-prone, β-strand-like residual structure when pH decreased from 8.0 to 6.0, even though thermal unfolding profiles retained a simple monophasic appearance regardless of pH. However, kinetic studies performed over a relatively wide temperature range (54−64 °C) revealed a complex unfolding mechanism comprising up to three observable phases, with largely different time constants, each accompanied by changes in secondary structure. Furthermore, a simple sequential mechanism is unlikely to explain the observed variation of amplitudes and rate constants with temperature. Rather than a simple sequential pathway, a complex mechanism involving off-pathway intermediates or even parallel pathways may be operating. This kinetic complexity is, however, not linked to the appearance of residual structure. On the other hand, the kinetic stability of yTIM (as reflected in the value of the rate constant for the main unfolding phase) showed a significant decrease in the pH range from 7.5 to 9.5, a range in which the conformation of the unfolded protein is typical of thermallyunfolded small proteins. That is, the appearance of β-strand residual structure is not related to significant changes in kinetic stability. In contrast, the presence of residual structure in denatured yTIM does apparently accelerate refolding at lower temperatures (42 °C), though it is clearly associated with increased irreversibility when the protein is brought back to 25 °C.
La enzima tiosafosfato isomerasa de Saccharomyces cerevisiae (yTIM) es una proteína dimérica formada por dos monómeros idénticos de 248 residuos amino acilo cada uno. En estudios de barrido térmico, esta proteína muestra transiciones conformacionales de desplegamiento y replegamiento que no son coincidentes (histéresis), lo cual es indicio de que las reacciones del proceso entre los estados nativo y desplegado son muy lentas, al menos en cierta región de temperatura. Los barridos de desplegamiento térmico de yTIM no sugieren la presencia de intermediarios estable durante el proceso; sin embargo, en estudios previos se ha mencionado la posible presencia de estructura residual en los monómeros desnaturalizados a temperaturas altas. En el presente trabajo se encontró que cuando el pH disminuye desde 8.0 hasta 6.0 la yTIM desnaturalizada térmicamente es propensa a agregarse, mostrando también una clara tendencia a formar estructura residual del tipo segmentos b. No obstante, los perfiles de desplegamiento térmico parecen corresponder a una transición simple (monofásica) independientemente del valor de pH. Estudios cinéticos realizados dentro de un intervalo relativamente amplio de temperatura (54 a 64 °C) revelaron que el mecanismo de desnaturalización consiste de hasta tres fases cinéticas observables con diferentes constantes de tiempo y acompañadas por cambios en la estructura secundaria. Además, la variación con la temperatura de las amplitudes de las fases y de las constantes de tiempo indican que el mecanismo es más complejo que un mecanismo secuencial sencillo; esto es, los resultados sugieren que el mecanismo cinético involucra intermediarios fuera de la vía secuencial y, tal vez, vías cinéticas paralelas. La complejidad del mecanismo, sin embargo, no está relacionada con la aparición de estructura residual en la proteína desnaturalizada. Por otra parte, la estabilidad cinética de la yTIM, reflejada en la constante de velocidad de la fase principal de desplegamiento, mostró una disminución significativa en el intervalo de pH de 7.5 a 9.5, intervalo en el cual la conformación de la proteína desplegada es semejante a la que adquieren proteínas pequeñas desplegadas térmicamente. Esto significa que la formación de estructura residual tipo b no está relacionada con cambios importantes en la estabilidad cinética. En contraste, la presencia de estructura residual en la yTIM desnaturalizada sí parece acelerar el replegamiento a temperaturas bajas (42 °C), pero también está asociada con un aumento de la irreversibilidad cuando, después de ser desnaturalizada, la proteína se lleva a 25 °C.
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