Síntesis de oligosacáridos fucosilados en medio convencional y no-convencional empleando la α-L-fucosidasa de Thermotoga maritima Public Deposited
La leche humana es el alimento ideal en los primeros meses de vida del infante y su composición está adaptada a sus necesidades nutricionales. En la leche humana se encuentran oligosacáridos fucosilados, los cuales tienen diversos efectos benéficos en la salud de los infantes. Debido a las ventajas anteriormente mencionas, el objetivo de este trabajo fue aumentar el rendimiento de síntesis de oligosacáridos fucosilados, evaluando los parámetros de pH, temperatura y actividad de agua (aw) en la actividad hidrolítica y de transglicosilación de la α-L-fucosidasa de Thermotoga maritima. La fucosidasa presentó un intervalo de pH óptimo de 6-8 para la actividad hidrolítica y de 7-10 para la actividad de transglicosilación. Además, al aumentar la temperatura se observó un incremento tanto en la actividad hidrolítica como de transglicosilación, obteniéndose la mayor actividad enzimática a 95 °C. Asimismo, la productividad más alta en la síntesis de oligosacáridos fucosilados (3.54 mM/h) se registró a pH 8 y 95 °C empleando pNP-fucosa (3.5 mM) como sustrato donador y lactosa (438 mM) como sustrato aceptor. Posteriormente se evalúo el efecto de la aw, la cual se disminuyó mediante la adición de dimetil sulfóxido (DMSO), acetona y acetonitrilo. En el medio de reacción con acetona (aw 0.97, 0.95 0.93) y acetonitrilo (aw 0.96, 0.93 y 0.91) se obtuvo una actividad hidrolítica mayor al 100% respecto al ensayo control (medio acuoso), mientras que con DMSO a aw< 0.99, la actividad hidrolítica disminuyó. Por otro lado, la adición de cosolventes influyó en la actividad de transglicosilación, obteniéndose un rendimiento menor en la síntesis de oligosacáridos fucosilados en el orden de acetona>DMSO >acetonitrilo (0.51>0.42>0.18 mM/h). La adición de acetona y DMSO favoreció la actividad de transglicosilación sobre la actividad hidrolítica, esto se comprobó al obtenerse una tasa de transglicosilación/hidrólisis (rS/H) de 1.21 y 1.43, respectivamente. Por el contrario, en el medio con acetonitrilo la actividad hidrolítica prevalece (rS/H 0.59), no obstante, con todos los solventes se obtuvo una mayor rS/H respecto al ensayo control (0.39). Adicionalmente, se evalúo el efecto de la temperatura en la estructura de la α-L-fucosidasa de T. maritima mediante simulación de dinámica molecular (DM). En las DM realizadas a 60-90 °C no se observaron cambios significativos en los valores del promedio de RMSD (RMSDprom) indicando la estabilidad de la enzima en ese intervalo de temperaturas, sin embargo, a 95 °C se registró un incremento significativo en el RMSDprom y promedio de RMSF (RMSFprom) reflejando cambios conformacionales importantes en la estructura de la enzima. Además, los resultados obtenidos indican que la temperatura contribuye a los cambios en la estructura secundaria de la enzima, ocasionando una disminución en el contenido de α-hélices con el subsecuente aumento de conformación irregular, lo que explicaría la pérdida de actividad enzimática a temperaturas elevadas (200 °C). Asimismo, la temperatura influye en la estructura secundaria del sitio activo de la enzima, el cual puede adoptar diferentes conformaciones: abierta, intermedia o cerrada. Finalmente, con la técnica de acoplamiento molecular se observaron diferencias en la interacción de la α-L-fucosidasa con los ligandos L-fucosa y pNP-Fuc, reflejándose en una menor energía libre de unión y una mayor afinidad de la enzima por el sustrato conforme se incrementó la temperatura.
Human milk is the ideal food during the first months in the new-born life with his composition adapted to their nutritional needs. Fucosylated oligosaccharides are found in human milk and have diverse beneficial effects on the health of infants. In this work, the effect of pH, temperature and water activity (aw) on both the hydrolytic and transglycosylation activity on the synthesis of fucosylated oligosaccharides was evaluated by using the α-L-fucosidase from Thermotoga maritima. The fucosidase show an optimum pH range of 6-8 for hydrolytic activity and 7-10 for transglycosylation activity. In addition, when temperature was raised, an increase on both the hydrolytic and transglycosylation activities was observed, obtaining the highest enzymatic activity at 95 ° C. Additionally, the highest productivity in the synthesis of fucosylated oligosaccharides (3.54 mM/h) was obtained at pH 8 and 95 ° C by using pNP-fucose (3.5 mM) as donor substrate and lactose (438 mM) as acceptor substrate. Subsequently, the effect of aw was evaluated; aw was decreased by the addition of dimethyl sulfoxide (DMSO), acetone and acetonitrile. In the reaction medium with acetone (aw 0.97, 0.95 0.93) and acetonitrile (aw 0.96, 0.93 and 0.91), a hydrolytic activity greater than 100% was obtained with respect to the control (water media), while with DMSO at aw <0.99, the hydrolytic activity decreased. On the other hand, addition of solvents affected the transglycosylation activity, as the yield of fucosylated oligosaccharides synthetized was in the order of acetone> DMSO> acetonitrile (0.51> 0.42> 0.18 mM/h). With the addition of DMSO and acetone, transglycosylation activity was favoured over the hydrolytic one, this by obtaining a transglycosylation/hydrolysis rate (rS/H) of 1.21 and 1.43, respectively; on the contrary, in the medium with acetonitrile, the hydrolytic activity prevailed (rS/H 0.59), however, all solvents allowed to obtain a higher rS/H compared to the control (0.39). Additionally, the effect of temperature on the structure of the α-L-fucosidase of T. maritima was evaluated by molecular dynamics simulation (DM). In the DM at 60-90 °C, no significant changes were observed in the average RMSD (RMSDavg)values, indicating the stability of the enzyme in that range of temperatures. However, at 95 °C there was a significant increase on both, the RMSDavg and average RMSF (RMSFavg) values, which reflect important conformational changes in the enzyme structure. Furthermore, results indicate that temperature contributes to changes in the secondary structure of the enzyme, causing a decrease in the content of α-helices with the subsequent increased in irregular conformation, which would explain the loss of enzymatic activity at high temperatures (200 °C). Likewise, the temperature influences the secondary structure of the active site of the enzyme, which can adopt different conformations: open, intermediate or closed. Finally, with the molecular docking technique, differences were observed in the interaction of α-L-fucosidase with the ligand L-fucose and pNP-Fuc, as the temperature increased a lower free binding energy and higher affinity of the enzyme for the corresponding substrate was observed.
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