Identificación de las glicoproteínas de espermatozoides de cerdo expresadas durante la capacitación Público Deposited
La capacitación es el proceso mediante el que los espermatozoides de mamíferos adquieren la capacidad de fertilizar al ovocito, ocurre en el tracto reproductor femenino, y se caracteriza por cambios en la composición y distribución de los componentes de la superficie del espermatozoide. Entre estos se pierde el colesterol y se redistribuyen las glicoproteínas de membrana plasmática. El objetivo de este estudio fue identificar las glicoproteínas que se expresan en espermatozoides de cerdo capacitados. Se analizaron muestras de espermatozoides normozoospérmicos de cerdo capacitados y no capacitados. Se aislaron glicoproteínas de espermatozoides por cromatografía de afinidad, utilizando las lectinas Con-A y WGA como ligandos fijados a una columna de sefarosa. La fracción retenida por la columna de afinidad se analizó por PAGE-SDS y electroforesis 2D y se secuenciaron los extremos N-terminal por degradación de Edman. La cantidad de proteínas extraídas de espermatozoides capacitados, comparada con la de espermatozoides no capacitados fue menor. En el análisis electroforético se encontró que, después de la capacitación, disminuye la proporción de las proteínas con masa molecular menor a 32 kDa. Estos resultados confirman que algunas proteínas fueron liberadas de la superficie del espermatozoide al realizarse la capacitación in vitro. Por medio de cromatografía de afinidad se encontró que la membrana plasmática de espermatozoides de cerdo presenta un gran número de proteínas unidas a residuos de manosa, N-acetilglucosamina y/o ácido siálico. Las proteínas retenidas por la lectina Con-A de espermatozoides no capacitados tienen masa molecular de entre 14 y 112 kDa. Mediante electroforesis bidimensional de proteínas de espermatozoides no capacitados, se observó que la familia de isoformas de 24 kDa desaparece al igual que las proteínas básicas menores de 20 kDa. Las proteínas totales de espermatozoides capacitados mostraron masas moleculares entre 14 y 102 kDa. Se encontró una banda mayoritaria de 68 kDa y dos de 52 y 47 kDa que corresponden a arilsulfatasa (AS-A), hialuronidasa y lactadherina, respectivamente. El patron de proteínas retenidas por Con-A (RP) mostró bandas de 14 a 98 kDa. La secuencia de la banda de 62 kDa correspondió a AS-A comparándola por BLAST en el banco de genes. La fracción RP por WGA mostró bandas de 14 a 100 kDa. La banda de 65 kDa también correspondió a AS-A. Este estudio demostró que AS-A tiene residuos de manosa y N-acetilglucosamina y/o ácido siálico como parte de su glicosiliación. Palabras clave: Arilsulfatasa-A, capacitación espermática, Con-A, espermatozoides de cerdo, WGA.
Capacitation is a sperm process necessary for fertilization. It occurs in female reproductive tract and it is characterized by membrane modifications including lose of cholesterol and glycoprotein redistribution. The aim of this study was to determine which of the mannose or N-acetylglucosamine and/or sialic acid glycoproteins were maintained in the membrane of capacitated boar sperm. Normospermic boar sperm, capacitated or not, were analyzed. Total proteins were injected in affinity columns with immobilized Con-A or WGA lectin. Retained fraction was analyzed by SDS-PAGE and 2-D electrophoresis. The N-terminal sequence of proteins was determined by Edman’s degradation. Total protein extracted from capacitated sperm was a small amount of that extracted from non-capacitated sperm. SDS-PAGE showed that proteins smaller than 32 kDa were lost in capacitated sperm. Affinity chromatography showed that there are many glycoproteins with mannose, N-acetylglucosamine and/or sialic acid residues. Proteins from non-capacitated sperm retained by the lectin Con-A have a Mr from 14 to 112 kDa. 2-D electrophoresis showed that a 24kDa protein family and the basic proteins smaller than 20kDa disappeared from non-capacitated sperm. Total capacitated sperm proteins electrophoresis showed molecular masses between 14 kDa and 102 kDa. A major band of 68 kDa, and 2 minor bands of 52 kDa and 47 kDa were observed. They were Arylsulfatase-A (AS-A), hyaluronidase and lactadherin, respectively. Con-A-retained proteins (RP) pattern showed bands from 14 to 98 kDa. After sequencing and BLAST analysis, the 62 kDa band corresponded to AS-A. The WGA RP fraction showed bands from 14 to 100 kDa. The 65 kDa band corresponded to AS-A. This study showed that AS-A has mannose and N-acetylglucosamine and/or sialic acid residues as part of its glycosilation. Keywords: Arylsulfatase-A, boar sperm, Con-A, sperm capacitation, WGA.
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