Comparación de la actividad de la vía señalización AMPc-PKA en la producción de Lovastatina por Aspergillus terreus en fermentación sólida y fermentación líquida Public Deposited
In this thesis was studied the functioning of the FadA-AMPc-PKA pathway linked to sporulation and the secondary metabolism of Aspergillus terreus. For this, some parameters indicative of the functioning of the c´AMP-PKA pathway were taken into account, during the production of lovastatin in in solid-state fermentation (SSF) and submerged fermentation (SmF). The first level studied was the expression pattern of the genes of the main components: fadA (α subunit of the G protein), laeA (global regulator of secondary metabolism) and its putative downstream targets: the specific transcriptional factor of the clúster biosynthetic of lovastatin, lovE, a polyketide synthase, lovF, and the main transcription factor of conidiation, brlA. In addition, the stress resistance genes atfB and msnA were also analyzed. The panorama was complemented with the profiles of intracellular concentration of c´AMP and the profile of PKA activity during SFF and SmF. In the transcription pattern of fadA, which perhaps reflects the activation of the pathway (separation and phosphorylation of this subunit), differential expression between SFF and SmF was found, suggesting that environmental stimuli in FS are perceived through this signaling pathway. In SFF, had a relatively low expression profile (except at 21 h) and more or less constant (slightly lower in idiofase). In contrast, in SmF, fadA was high in trophophase (18 h) and low from 21 h until idiofase. This expression profile of fadA was opposite to the c´AMP concentration pattern and with the PKA activity pattern in both culture systems. A direct relation of these two variables with fadA was expected, however, similarity was only found between the profiles of c´AMP and PKA. In SSF, both the intracellular concentration of c´AMP and the PKA activity showed high levels in trophophase, decreasing at 21 h and being slightly constant in idiofase, indicating a negative regulation on lovE/lovF (probably through LaeA). However, in SmF, a completly opposite behavior was observed: low in trophophase and increased in idiofase (slightly increased PKA activity, similar to the level in SSF), these results being controversial. On the other hand, the expression results of the brlA gene also indicate that the conidiation is negatively regulated by PKA (in SSF, in SmF there was no sporulation). In relation to the transcription factors (FT´s) of stress response, msnA showed a transcription pattern somewhat inverse to the activity of PKA (more expression in idiofase). In contrast, atfB showed a more intense transcription in trophophase, perhaps regulated positively by PKA, although it could have influence of the SAPK MAPKinase pathway. As for the laeA gene, it was found that its expression profile, both in SSF and in SmF, is opposite to the expression of lovE and lovF (and synthesis of lovastatin). That is, it is expressed strongly in trophophase and slightly in idiofase. This was unexpected, so the expression profile does not seem to be a good indicator of LaeA activity. The results suggest that the expression of laeA is present from the trophophase, but is activated by a post-transcriptional or posttranslational regulation, in idiofase. This, probably due to a negative regulation by PKA, particularly in SSF. On the other hand, transformants that overexpressed the laeA gene (SE::laeA) were characterized (under any of the 2 strategies used: with own promoter and with a constitutive promoter). The results showed that both strategies were very good methods of molecular genetic improvement, especially for SSF. In SE::laeA overproducing strains of lovastatin were generated especially for SSF, and in less abundance for SmF. A greater sporulation was also observed in SSF, confirming LaeA as a regulator of secondary metabolism and a positive regulator in sporulation. The best transformants for SSF (T9laeA and T2laeAcons) and for SmF (T1laeA and T5laeAcons) showed an extension or prolongation of their production stage, this being an important factor in the increase of production. In SSF, the transformant with constitutive promoter, T2laeAcons, produced 30.6 mg of lovastatin/gss (104% increase). In SmF, the transformant with its own promoter, T1laeA, produced 0.89 mg /mL (102% increase).
En esta tesis se estudió, el funcionamiento de la vía FadA-AMPc-PKA ligada a esporulación y al metabolismo secundario en Aspergillus terreus. Con relación a este último, se sabe que la producción de lovastatina es mayor en fermentación sólida (FS) que en fermentación líquida (FL). Para ello, se tomaron en cuenta algunos parámetros indicativos del funcionamiento de la vía AMPc-PKA, durante la producción de lovastatina en FS y FL. El primer nivel estudiado fue el patrón de expresión de los genes de los componentes principales: fadA (subunidad α de la proteína G), laeA (regulador global del metabolismo secundario) y sus blancos putativos corriente abajo: el factor transcripcional específico del “clúster” biosintético de lovastatina, lovE, una policétido sintasa, lovF, y el factor transcripcional principal de conidiación, brlA. Además, también se analizaron los genes de resistencia a estrés atfB y msnA. El panorama fue complementado con los perfiles de concentración intracelular de AMPc y el perfil de la actividad PKA durante los cultivos sólido y líquido. En el patrón de transcripción de fadA, que refleja la activación de la vía (separación y fosforilación de esta subunidad) se encontró expresión diferencial entre FS y FL, sugiriendo que estímulos ambientales en la FS son percibidos por esta vía, donde el patrón de transcripción tuvo un perfil relativamente bajo (excepto a las 21 h) y más o menos constante (ligeramente más bajo en idiofase). En contraste, en FL, fadA fue alto en trofofase (18 h) y bajo desde las 21 h hasta idiofase. Coincidiendo con la lógica del esquema de regulación propuesto por el grupo de Nancy Keller para otras especies de Aspergillus. Otros parámetros estudiados también indicaron un funcionamiento diferente en ambos sistemas de cultivo. Se encontraron diferencias en el perfil de concentración intracelular de AMPc y de la actividad PKA durante los distintos cultivos, ambos componentes tuvieron comportamiento similar en cada cultivo estudiado, pero opuesto a la expresión de fadA. Se esperaba una relación directa de estas dos variables con fadA. En FS, tanto la concentración intracelular de AMPc como la actividad PKA mostraron niveles altos en trofofase (bajando a las 21 h y siendo ligeramente constante en idiofase) indicando una regulación negativa en trofofase sobre lovE/lovF (probablemente a través de LaeA)Esto Tesis de Doctorado en Biotecnología 6 también se esperaba, de acuerdo al esquema de regulación propuesto por Keller y colaboradores. Pero, en FL, el comportamiento fue completamente opuesto, bajos en trofofase y subieron en idiofase (ligeramente subida de actividad PKA, similar que en FS), siendo controversial estos resultados. Sin embargo, la expresión de fadA, opuesto a ellos, si fue el esperado. Por otro lado, los resultados de expresión del gen brlA también indican que la conidiación es regulada negativamente por PKA (en FS, en FL no hubo esporulación). En relación con los factores de transcripción (FTs) de respuesta a estrés, msnA mostró un patrón de transcripción en cierto modo inverso a la actividad de PKA (más expresión en idiofase). En contraste, atfB mostró una transcripción más intensa en trofofase, quizás regulada positivamente por PKA, aunque podría tener influencia de la vía SAPK MAPKinasa. En cuanto al gen laeA, se encontró que su perfil de expresión, tanto en FL como en FS, es opuesto a la expresión de lovE y lovF (y síntesis de lovastatina). Es decir, se expresa fuerte en trofofase y ligeramente en idiofase. Esto fue inesperado, por lo que el perfil de expresión parece no ser un buen indicador de la actividad de LaeA. Los resultados sugieren que la expresión de laeA está presente desde la trofofase, pero es activada por una regulación posttranscripcional o post-traduccional, en idiofase. Esto, probablemente debido a una regulación negativa por PKA, particularmente en FS. Por otra parte, se caracterizaron transformantes que sobreexpresaron el gen laeA (SE::laeA) (bajo cualquiera de las 2 estrategias usadas: con propio promotor y con un promotor constitutivo). Los resultados demostraron que ambas estrategias fueron muy buenos métodos de mejoramiento genético molecular, sobre todo, para generar cepas sobreproductoras de lovastatina especialmente para FS, y en menos abundancia para FL. También se observó, que las mejores transformantes en FS tuvieron una mayor esporulación, confirmando a LaeA como regulador del metabolismo secundario y regulador positivo en la esporulación. Las mejores transformantes para FS (T9laeA y T2laeAcons) y para FL (T1laeA y T5laeAcons) mostraron una extensión o prolongación de su etapa de producción, siendo esto un factor importante en el incremento de la producción. En FS, la transformante con promotor constitutivo, T2laeAcons, alcanzó 30.6 mg de lovastatina por gss (104% de incremento). En FL, la transformante con promotor propio, T1laeA, produjo 0.89 mg/mL (102% de incremento).
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