Efecto de la insulina en la activación y localización de proteínas de la vía TOR-S6K en embriones de maíz (Zea mays L.) en germinación Público Deposited
En el proceso de germinación de las semillas, la reactivación del metabolismo inicia desde las primeras horas de imbibición, hay síntesis de proteínas, aumenta la biomasa, inicia el crecimiento por expansión celular necesario para la protrusión de la radícula y en etapas postgerminativas hay proliferación celular y crecimiento de la plántula. En eucariotas está conservada la vía de señalización TOR-S6K que integra señales ambientales, hormonales, insulina (factores de crecimiento semejantes a insulina o IGFs) y de nutrimentos para modular la proliferación y el crecimiento celular a través de estimular la biogénesis de ribosomas y la síntesis de proteínas. En maíz se ha detectado un factor de crecimiento similar a la insulina, denominado ZmIGF que estimula la germinación y el crecimiento principalmente en la radícula, se han reportado algunos intermediarios de la vía TOR-S6K que se activan en presencia de insulina/ZmIGF, promoviendo la biogénesis de ribosomas y la síntesis de proteínas. Entre las proteínas sintetizadas están las ribosomales (PR), pero no todas se regulan de la misma manera. Se ha reportado que la insulina induce la síntesis de PRS6 y PRL7, mientras que en el caso de PRL3 hay un incremento de los transcritos pero no de la proteína. Las proteínas PRS6 y PRL7 aparte de formar parte de la estructura del ribosoma regulan el reclutamiento de ARNm específicos y de factores de inicio de la traducción. En este trabajo se estudió la localización tisular de proteínas de la vía TORS6K, así como PRS6, PRL7 y PRL3 mediante inmunohistoquímica. Se observó que a las 24 h de imbibición, la insulina estimula proteínas de la vía como RAPTOR, TOR, S6K y sus formas fosforiladas: P-TOR (Ser-2448) y P-S6K (Tre-389). Las marcas de inmunotinción se ubicaron en tejidos como el primer primordio foliar, en el mesocotilo; también en la zona de alargamiento, zona meristemática y la cofia del ápice radicular. PRS6 y PRL7 se localizaron en la zona de alargamiento, la zona meristemática y la cofia de radículas de embriones en germinación. En tejidos de la plúmula, la zona de alargamiento de la raíz y la cofia se ubicó con un patrón polarizado a P-S6K y P-TOR en la cara lateral cercanas a la membrana plasmática de la célula en un patrón polarizado. Para estudiar la localización celular polarizada observada, se analizó mediante microscopía confocal la localización de PRL7 en radículas de embriones de maíz a distintos tiempos de imbibición estimulados con insulina. PRL7 es una de las dianas finales de la vía TOR-S6K que incrementa su biosíntesis por insulina. Se observó que en los tratamientos con insulina, las marcas de fluorescencia de PRL7 se incrementan conforme aumenta el tiempo de imbibición (18, 24 y 36 h), con respecto a radículas de embriones testigo. A las 24 h se observó mejor la localización polarizada de esta proteína en una de las caras de la célula. Como se mencionó la proteína PRL7 se detectó en tejidos como la zona de alargamiento, zona meristemática y la cofia del ápice radicular, en embriones estimulados con insulina. En tejidos de la raíz desde la corteza, la zona de alargamiento y las células madre del floema, la PRL7 se ubicó en la cara lateral en dirección al cilindro central; en las células del cilindro central se ubicó sobre la cara apical y en células de la columela se ubicó sobre la cara basal. Al realizar un análisis de morfometría de las estirpes celulares a partir del centro quiescente se observó que la insulina acelera la polarización y estimula preferencialmente el crecimiento longitudinal. Los resultados de este trabajo evidencian la participación de la vía TOR-S6K en la inducción de la germinación por insulina y aportan nuevo conocimiento sobre los tejidos del eje embrionario que son estimulados por este efector. Además de mostrar que a nivel celular la insulina induce su ubicación polarizada. Esta localización polarizada y sus implicaciones fisiológicas requieren estudios posteriores.
In the seed germination process, reactivation of metabolism starts from the first hours of imbibition, protein synthesis takes place, biomass increases and there is growth through cellular expansion for the protrusion of the radicle, while in post-germination stages cell proliferation and growth of the seedling occur. In eukaryotes, the TOR-S6K signaling pathway that integrates environmental signals, hormonal signals, insulin (insulin-like growth factors or IGFs) and nutrients to modulate cell growth and proliferation, is preserved by stimulating ribosome biogenesis and protein synthesis. An insulin-like growth factor, namely ZmIGF, has been detected in maize. This factor stimulates germination and growth, mainly in the radicle, some intermediaries of the TOR-S6K pathway that are activated in the presence of insulin / ZmIGF have been reported, promoting ribosome biogenesis and protein synthesis. Among the proteins synthesized are the ribosomal protein (RP), but not all are regulated in the same way. It has been reported that insulin induces the synthesis of RPS6 and RPL7. In the case of RPL3 there is an increase in transcripts but not in the protein levels. RPS6 and RPL7 proteins, apart from being part of the ribosome structure, regulate the recruitment into ribosomes of specific mRNAs and translation initiation factors. In this work, tissue localization of proteins of the TOR-S6K pathway, as well as RPS6, RPL7 and RPL3 were studied by means of immunohistochemistry. It was observed that at 24 h of imbibition, insulin stimulates pathway proteins such as RAPTOR, TOR, S6K and their phosphorylated forms P-TOR (Ser2448) and P-S6K (Tre-389). Immunostaining marks were located in tissues such as the first leaf primordium, in the mesocotil; as well as in the zone of cell elongation, the meristematic zone and the cap at the root apex. RPS6 and RPL7 were located in tissues of the radicle such as the zone of cell elongation, the meristematic zone and the root cap of germinating embryos. In tissues of the plumule, elongation zone and root-cap, it was observed that P-S6K and PTOR were located on the lateral side near the plasma membrane of the cell, in a polarized pattern. To study the observed polarized cell localization, RPL7 localization in radicles of maize embryos at different times of imbibition in the presence of insulin, was analyzed by confocal microscopy. RPL7 is one of the final products of TOR-S6K pathway whose synthesis is stimulated by insulin. In treatments with insulin, an increase of RPL7 fluorescence marks was observed as imbibition time increased (18, 24 and 36 h), with respect to control embryos. At 24 h, the polarized localization of this protein on one side of the cell was better observed. As mentioned, RPL7 was detected in tissues such as the zone of cell elongation, the meristematic zone and the root- cap, in embryos stimulated with insulin. In root tissues RPL7 was located, from cortex, the zone of cell elongation and the phloem stem cells, on the lateral side in the direction of the central cylinder; in the apical side of cells of the central cylinder and on the basal side of columella cells. When performing a morphometric analysis of cell lines from the quiescent center, it was observed that insulin accelerates polarization and preferentially stimulates longitudinal growth. The results of this work confirm the participation of the TOR-S6K pathway in the induction of insulin germination and provide new knowledge about the tissues of the embryonic axis that are stimulated by this effector, in addition to showing that at cellular level insulin induces their polarized localization. This polarized location and their physiological implications require further studies.
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