Modificación estructural de quitina mediante métodos físicos y químicos para su hidrólisis enzimática mediante quitinasas de Lecanicillium lecanii Public Deposited
La quitina es uno de los polisacáridos más abundantes en la naturaleza, se encuentra como un componente estructural del exoesqueleto de crustáceos e insectos y en las paredes celulares de algunos hongos y levaduras. Se utiliza, como materia prima, para la producción de compuestos derivados, tales como el quitosano y oligosacáridos, así como para la obtención de N-acetil glucosamina y glucosamina, derivados que se pueden obtener por vías químicas o enzimáticas. En esta última, las quitinasas, que son glicosil hidrolasas del enlace β-1-4, son capaces de convertir la quitina a quitinoligosacáridos; las producen una gama de microorganismos amplia, dentro de los que destacan los hongos entomopatógenos, donde actúan sinérgicamente con proteasas y lipasas en el proceso de patogénesis de la infección, para degradar la cutícula de los insectos, además de estar implicadas en procesos como la germinación, crecimiento de las hifas, morfogénesis, nutrición y defensa contra competidores y pueden utilizarse como control biológico de insectos plaga. Los quitino-oligosacáridos son productos de alto valor agregado difíciles de obtener debido la alta cristalinidad y baja solubilidad de la quitina, además la hidrólisis química, que es el proceso mas común de obtención, tiene como consecuencia la desacetilación de los productos.Por lo que el objetivo del presente trabajo fue producir oligosacáridos por hidrólisis enzimática, mediante quitinasas, de quitinas de Lecanicillium lecanii modificadas estructuralmente. Las quitinasas se obtuvieron en cultivo sumergido, se evaluaron los medios Mineral y Czapeck, se determinó el efecto en la producción enzimática de la fuente de carbono (quitina coloidal y cruda), así como del pH del cultivo. Los extractos enzimáticos se purificaron parcialmente mediante cromatografía de exclusión molecular. Por otra parte, se modificó estructural la quitina mediante ultrasonicación, tratamiento mecánico de trituración, desacetilación FPT (freezingdegassing-thawing), expansión rápida con 1,1,1,2 tetrafluoroetano (R134a) y steam explosion. Para esta última tecnología, se evaluó el efecto que tienen la temperatura y la presión en la modificación del polímero tratado. Por último, se analizó la estructurade los productos obtenidos de la hidrólisis de los substratos quitinosos, en cuanto a grado de polimerización y fracción molar acetilada.
La producción mayor, tanto de Endoquitinasa como de N-acetilhexosaminidasas, se presentó en el medio Czapeck con quitina coloidal como fuente de carbono (10 g/L) y modificando el pH durante el cultivo, las actividades obtenidas fueron de 2.26 y 0.029 U/mL para endoquitinasa y N-acetilhexosaminidasa respectivamente, los cultivos realizados a pH fijo mostraron actividades enzimáticas significativamente menores. Una vez purificados los extractos enzimáticos, se analizaron por electroforesis encontrando bandas de 50 y 37 kDa, que, según la bibliografía, pueden corresponder a enzimas quitinolíticas. Asimismo, la presencia de actividad, tanto Endoquitinasa como N-acetilhexosaminidasa, se corroboró, en la etapa de exclusión molecular, mediante zimogramas. La modificación estructural de las quitinas mediante tratamiento de expansión rápida de R134a, combinado con la fibrilación, presentó la disminución en el índice de cristalinidad mayor (68.8%), sin llegar a reducir drásticamente la acetilación en comparación con la quitina pura la cual presentó un DA de 98.14%. En algunos de los tratamientos, como el de ultrasonicación, se detectaron azúcares reductores (0.02 mg/mL) y monómeros de N-acetilglucosamina (0.16mg/mL), desde tiempos iniciales, lo que sugiere que estos tratamientos podrían estar provocando la hidrólisis de la quitina. La temperatura y presión en este tratamiento parecen ser factores fundamentales que influyen directamente en las características finales de la quitina, es decir a temperaturas y presiones mayores, disminuye más el índice de cristalinidad (10%), pero también empieza a disminuir la acetilación (alrededor del 9%) esto, comparado con la quitina empleada como materia prima para este tratamiento. Los sustratos quitinolíticos que presentaron mayor producción de quitinoligosacáridos fueron la quitina tratada por explosión de vapor y la quitina modificada por expansión de 1,1,1,2 tetrafluoroetano supercrítico combinado con la fibrilación, alcanzando una producción de azúcares reductores de 0.37 y 0.18 mg/mL, respectivamente. Encontrando que el grado de polimerización fue de entre 2 y 5 en ambos casos y la FA de 0.28 y 0.45 para el sustrato de steam explosión y fibrilación respectivamente en los quitinoligosacáridos tratados.
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