Mecanismos alternos de expresión de la actividad estrogénica del gestodeno, una progestina sisntética de tercera generación Público Deposited
Gestodene (GSD; 13p-ethyl-I 7a-ethynyl-l7p-hydroxy-4,15-gonadien-3-one) is the most potent synthetic progestin currently available and it is widely used as a fertility regulating agent in a number of contraceptive formulations because of its high effectiveness, safety and acceptability. The observations that this contraceptive synthetic progestin exerts estrogen-like effects besides that of its progestational activity, prompted the conduction of the present investigation to understand the underlying mechanisms through which GSD administration induces estrogenic effects, even though this synthetic steroid molecule neither interacts with intracellular estrogen receptors (ER) nor undergoes in vivo aromatization. The research hypothesis behind the rationale and experimental studies of this work establishes that the slight estrogen-like effects observed after GSD administration are exerted by its enzyme-formed A-ring reduced derivatives, at peripheral organs, which specifically bind with a high relative affinity to the active site of the ER, and are able to transactivate estrogen-regulated genes at hormone sensitive tissues. To assess whether GSD, like other 19-nor synthetic progestins, could be biotransformed to non-phenolic metabolites with intrinsic estrogenic potency, at the target organ level, homogenates of castrated female rat anterior pituitaries and hypothalami, as well as castrated male rat ventral prostates were incubated in vitro with different concentrations of [3H]- and [14C]-labeled GSD at different pH, in the presence or absence of the cofactor NADPH. The isolation, purification and identification of GSD metabolites were done by a reverse isotope dilution technique which included thin layer chromatography in, at least, two different systems and repeated crystallizations to obtain constant specific activity. Incubations of rat anterior pituitaries, hypothalami and ventral prostates homogenates with [3H]-testosterone, under identical experimental conditions, were used as positive controls, while tissuefree incubations served as negative controls. The results provided evidence that GSD was extensively metabolized to A-ring reduced derivatives in the steroid hormone-sensitive tissues studied. The formation of radioactive 5a-dihydroGSD (5aGSD), 3a,5a-tetrahydroGSD (3a15aGSD) and 3P15a-tetrahydroGSD (3P15aGSD) was demonstrated, thus indicating that GSD is an adequate substrate for 5a-steroid reductases and 3a- and 3P-hydroxysteroid dehydrogenases. The bioconversion of GSD to 5aGSD in the rat pituitary and hypothalamus occurred only at pH 7.4, whereas a lack of biotransformation of GSD was observed when incubations were performed at pH 4.8, thus indicating the activity of 5a reductase type 1 only. In contrast, 5aGSD was the major product obtained in rat ventral prostate incubations at both pH 7.4 and 4.8, indicating the presence of Sa-steroid reductase type1 and 5asteroid reductase type 2, respectively. In all tissue incubations the activity of 5asteroid reductase was NADPH dependent. The most important finding in these studies was the isolation and identification of 3a15aGSD and 3P15aGSD in the three target organs, which is in line with previous reports indicating that other synthetic 19-nor contraceptive progestins, exhibit a similar metabolic conversion pattern. To investigate whether the estrogen-like effects of GSD are mediated by some of its A-ring reduced metabolites, a series of experimental studies were undertaken using different biochemical and molecular approaches. First of all, the stereospecificity of the binding of GSD and its 5a-reduced metabolites to the intracellular ER was assessed by competition analysis. The relative binding affinity and the inhibition constant of GSD and its derivatives to ER were determined in aliquots of immature rat uterine cytosol, incubated with [3H]-estradiol as radioligand, in the presence of increasing concentrations of radioinert GSD, SaGSD, 3a,5aGSD, 3p,5aGSD and estradiol (Ez). The results confirmed that indeed GSD does not bind to the ER and demonstrated that its tetrahydro 3p,5a derivative and, to a lesser extent, its 3a,5a epimer interacted with a high relative affinity with the ER, though with a significantly lower binding affinity than naturally occurring E*. The ability of increasing concentrations of GSD and its A-ring reduced derivatives to induce estrogenic activities were evaluated in HeLa cells transiently transfected with an expression vector, for either human ERa (hERa) or human ERP (hERp) genes and estrogen responsive elements fused to the chloramphenicol acetyltransferase (CAT) reporter gene. The results demonstrated that 3PGSD and 3aGSD were able to activate, in a dose dependent manner, the hERa-mediated but no the hERP-mediated transcription of the CAT reporter gene in the HeLa cells expression system. The 3p derivative of GSD exhibited a significantly higher estrogenic effect than its 3a isomer, while unchanged GSD and SaGSD were completely ineffective. However, It must be stressed that the potency of the GSD reduced metabolites to transactivate the CAT reporter gene was significantly lower than that of naturally occurring E2 The in vivo estrogenic potency of 3PGSD was also assessed by its capability induce estrogen-dependent progestin receptors (PR) in the anterior pituitary castrated female rats, after administration of three different doses (0.5, 1.0 and 1 to of .5 mg/day) for 6 consecutive days. The characteristics of PR induced by the highest doses of 3P,5aGSD were determined using a sucrose gradient labeling technique. The sedimentation coefficient (7-9 S) of the complexes formed after incubation of aliquots of anterior pituitaries cytosol with I3H]-ORG 2058 were identical to that induced by estradiol benzoate (E2B) used as experimental control. The results showed a significant dose-dependent increase of PR in the anterior pituitaries of castrated rats, as compared to vehicle treated animals, though with significantly lower potency than that observed after administration of E2B. The overall results confirmed the proposed hypothesis that peripheral metabolism of Gestodene modulates its hormone-like effects and pointed out the relevance of the biotransformation of GSD to 3pGSD and its 301 isomeric alcohol, which specifically bind to the ER and possess a weak intrinsic estrogenic activity. The data also contribute to a better understanding of the GSD mechanisms of action and allow to conclude that the slight estrogen-like effects attributable to GSD are indeed mediated by its non phenolic, tetrahydro reduced metabolites.
El Gestodeno (GSD; 13p-etil-I 7a-etinil-l7p-hidroxi-4,15-gonadien-3-ona) es la progestina sintética mas potente disponible actualmente y se utiliza en diversas formulaciones farmacéuticas como agente regulador de la fertilidad debido a su gran efectividad, seguridad y aceptabilidad entre las usuarias. Las observaciones clínicas y experimentales de que el GSD puede ejercer efectos hormonales de tipo estrogénico, además de su efecto progestacional, motivaron la realización del presente estudio de investigación, orientado a esclarecer el o los mecanismos por los cuales el GSD induce efectos estrogénicos después de su administración, aun cuando esta molécula esteroide sintética es incapaz de interactuar con los receptores intracelulares de estrógenos y tiene impedimentos estéricos para bioconvertirse in vivo a estrógenos, a través de aromatización enzimática. La hipótesis de trabajo que sustenta los estudios experimentales de esta investigación, establece que los efectos de tipo estrogénico observados después de la administración de grandes dosis de GSD son mediados a través de sus metabolitos reducidos en el anillo A, los cuales son formados en órganos hormonosensibles e interactúan específicamente y con una alta afinidad de unión relativa, con los receptores intracelulares de estrógenos a través de los cuales se activan genes estrógeno-dependientes. Con el objeto de establecer si el GSD, al igual que otras progestinas de la serie 19- nor, se biotransforma, a nivel de órganos blanco, a diversos metabolitos reducidos en el anillo A, se incubaron homogeneizados de hipotálamo e hipófisis anterior de ratas hembras adultas castradas y de próstata de ratas machos castrados, con diferentes concentraciones de GSD-[3H] y GSD-[14C], a diferentes pH, en presencia y ausencia de NADPH. La separación, purificación e identificación de los metabolitos de GSD formados durante las incubaciones, se realizó por el método de dilución isotópica inversa, que incluye cromatografía en placa fina en dos sistemas de disolventes de diferente polaridad y cristalizaciones repetidas de los productos aislados, hasta la obtención de actividad específica constante. Una serie de incubaciones bajo las mismas condiciones experimentales, empleando test~sterona-[~H] como substrato radiactivo, se utilizó como control positivo, mientras que incubaciones en ausencia de tejido fueron los controles negativos. Los resultados obtenidos demostraron que el GSD se biotransformó a los derivados 5a-dihidroGSD (5aGSD), 3a,5atetrahidroGSD (3a,5aGSD) y 3p,Sa-tetrahidroGSD (3P,SaGSD), mostrando la actividad e las enzimas Sa-esteroide reductasas y 3a- y 3P-hidroxiesteroide deshidrogenasas en los tejidos estudiados. La biotransformación del GSD a SaGSD se observó en las incubaciones de las hipófisis e hipotálamos de rata, únicamente a pH de 7.4, demostrando la actividad de la 5a-reductasa tipo 1. En contraste, en las incubaciones de próstata el derivado 5a-reducido del GSD se formó tanto a pH de 4.8 como de 7.4, lo cual demostró la actividad de las 5a-esteroide reductasas tipo 1 y tipo 2. En todos los tejidos estudiados la actividad de la 5a-esteroide reductasa fue dependiente del cofactor NADPH. El hallazgo más importante en estos experimentos fue la formación de 3a,5aGSD y 3p,5aGSD, lo cual concuerda con la demostración previa de que otras progestinas sintéticas anticonceptivas de la serie 19-nor, como la Noretisterona y el Levonorgestrel, estructuralmente semejantes al GSD, exhiben un patrón metabólico similar. La estereoespecificidad de unión del GSD y sus derivados reducidos en el anillo A, con el receptor intracelular de estrógenos (RE) se estudió por medio de un análisis de competencia, incubando el citosol del úter0 de ratas hembras prepúberes, como fuente de receptores de estrógenos, con e~tradiol-[~H] (E2-[3H]) como radioligando específico, en presencia de concentraciones crecientes de los esteroides competidores radioinertes: estradiol (E2), GSD, 5aGSD, 3a,5aGSD y 3p,5aGSD. La afinidad de unión relativa y la constante de inhibición de los esteroides estudiados, confirmaron que el GSD no se une al RE y demostraron que el derivado reducido 3P,5a y, en menor proporción, su epímero 3a,5a interactúan con el RE, aunque con una afinidad de unión significativamente menor que la del E2. La capacidad de diferentes concentraciones de GSD y de sus derivados dihidro y tetrahidro reducidos para inducir actividades biológicas de tipo estrogénico, se estudió en un sistema de expresión en células HeLa co-transfectadas transitoriamente con los genes de los receptores humanos de estrógenos tipo a ó tipo p, como vectores de expresión, y como vector reportero al gen de la cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) fusionado con elementos que responden a estrógenos. Los resultados demostraron que el 3pI5aGSD y en menor proporción el 3aI5aGSD, activaron en forma dosis-respuesta la transcripción de los genes reporteros de CAT en las células HeLa, a través del receptor humano de estrógenos tipo a (RaE), mientras que el GSD y el 5aGSD fueron completamente inactivos. En forma por demás interesante, los metabolitos 3p,5a y 3a3a del GSD fueron incapaces de inducir la transactivación de CAT a través del receptor de estrógenos humano tipo p (RPE). La potencia estrogénica del 3PI5aGSD para inducir in vivo el receptor de progesterona dependiente de estrógenos (RP) en la hipófisis anterior de la rata hembra adulta castrada, se determinó después de administrar a los animales, durante seis días consecutivos, tres diferentes dosis (0.5, 1.0 y 1.5 mgldía) del metabolito reducido del GSD. Las características del RP, inducido por la administración de las dosis más altas del 3Pl5aGSD, se determinaron empleando un gradiente lineal de sacarosa El coeficiente de sedimentación (7-9 S) de los complejos formados después de la incubación de alícuotas del citosol de las hipófisis anteriores con ORG 2058-[3H], fue idéntico al inducido con el tratamiento con benzoato de estradiol (BE2), utilizado como control experimental positivo. Los resultados demostraron un incremento significativo, dosis-respuesta, del RP en la hipófisis anterior de las ratas tratadas con el derivado 3p, SaGSD, en comparación con los obtenidos en los animales utilizados como controles negativos a los cuales se les administró únicamente el vehículo. Sin embargo, el incremento inducido por el 3P,5aGSD fue significativamente menor al inducido con el BE2. El análisis integral de los resultados obtenidos en este estudio, confirmó la hipótesis de trabajo propuesta al demostrar la relevancia del metabolismo periférico del GSD como modulador de sus efectos de tipo estrogénico. Los hallazgos experimentales claramente revelaron que la bioconversión de GSD a sus metabolitos reducidos 3P,5a y 3a,5a es esencial para inducir la transactivación de genes dependientes de estrógenos, a través de su unión al RaE. El estudio también demostró que la potencia de los metabolitos del GSD para inducir efectos estrogénicos, fue significativamente menor que la observada con el E2. En conjunto, los resultados obtenidos en la serie de experimentos realizados, permitieron dar cumplimiento a los objetivos general y específicos planteados al inicio del estudio, ampliando el conocimiento de los mecanismos de acción hormonal de la progestina anticonceptiva Gestodeno.
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