Diagnóstico molecular diferencial del virus Dengue y Chinkungunya, utilizando la técnica de ampliación isotérmica mediada por “asa” (RT-LAMP) Público Deposited
El incremento de arbovirosis en los últimos años por la co-circulación de los mosquitos Aedes aegypti y A. albopictus ha facilitado la diseminación de nuevos virus en zonas donde los recursos para el diagnóstico son limitados. En México, el Dengue es considerado endémico, el primer brote de Chikungunya fue en el 2015, seguido de un brote de Zika en el 2016, dificultando el diagnóstico por la similitud de los síntomas y la reactividad cruzada entre flavivirus. Actualmente en México, la confirmación del diagnóstico se realiza en los laboratorios de referencia, mediante una RT-qPCR trioplex o una ELISA, por lo que es necesario implementar métodos de detección menos costosos, rápidos y accesibles como lo es la amplificación isotérmica mediada por “asa” (LAMP). LAMP amplifica a una temperatura constante a partir de DNA o RNA, ya que emplea una Bst DNA polimerasa que puede actuar como retrotranscriptasa y posee actividad de desplazamiento de cadena, la especificidad del ensayo es debido al diseño de cuatro primers que flanquean seis regiones diferentes del genoma. El objetivo de este trabajo fue establecer dos sistemas de detección del genoma viral mediante RT-LAMP para Dengue y Chikungunya, la estandarización se llevó a cabo bajo condiciones controladas a 65ºC, el tiempo de la reacción se estableció en 45 min para CHIKV y 1h para DENV, se incluyó al ZIKV como control de especificidad de primers para DENV, los productos amplificados se visualizaron en un gel de agarosa. Los ensayos de RT-LAMP fueron evaluados por duplicado en 95 muestras de plasma obtenidos de pacientes con sospecha de infección por DENV o CHIKV en Veracruz durante septiembre-octubre de 2015. Como estándar de oro se empleó un ensayo de RT-qPCR que incluía los 4 serotipos de DENV, ZIKV, CHIKV, Virus de la fiebre amarilla (YFV) y al Virus del Oeste del Nilo (WNV). También se empleó una RT-PCR de punto final y se realizó la serología para detección de IgM de DENV y CHIKV en las muestras. El resultado por RT-LAMP y RT-qPCR para DENV fueron 2/95 muestras positivas, para CHIKV por RT-qPCR se obtuvieron 41/95 muestras positivas para CHIKV y por RT-LAMP fueron 45/95 muestras positivas, de las cuales 13/95 son falsos positivos y 9/95 son falsos negativos. La sensibilidad y especificidad del ensayo de RT-LAMP para DENV fue del 100%, no se detectó hibridación inespecífica entre DENV y ZIKV. El ensayo de RT-LAMP para CHIKV tuvo una sensibilidad del 78% y una especificidad del 75% comparado con el ensayo de RT-qPCR. La detección de IgM para DENV se encontró en 4/95 muestras y la IgM para CHIKV en 36/95 muestras. El resultado conjunto de las pruebas moleculares y serológicas demuestran que 66/95 pacientes tuvieron infección por CHIKV. No se detectó Zika en ninguna de las muestras. El ensayo de RT-LAMP, demostró su utilidad para detectar el genoma de DENV y CHIKV en muestras de pacientes, permitiendo así implementar otra herramienta para el diagnóstico temprano en los sitios que se presentan los brotes epidémicos.
The increase of arboviruses in recent years due the co-circulation of Aedes aegypti and A. albopictus mosquitoes has facilitated the spread of new viruses in areas where diagnostic resources are limited. For many years Dengue virus (DENV) has been endemic in Mexico, but first Chikungunya virus (CHIKV) outbreak occurred during 2015, followed by Zika outbreak in 2016, compromising the diagnosis by the similarity of symptoms and cross-reactivity between DENV and Zika virus (ZIKV). In Mexico, the diagnosis is performed by reference laboratories, using RT-qPCR trioplex or ELISA assay, so is necessary implement less expensive, rapid and specific detection methods as loop-mediated isothermal amplification (LAMP). LAMP amplifies at isothermal temperature using DNA or RNA as template, this method employs a Bst DNA polymerase with retrotranscriptase and strand displacement activity, and a set of four specially designed primers that recognize a total of six distinct sequences on the target DNA. The aim of this work was to establish two detection systems of viral genome using RT-LAMP for DENV and CHIKV, standardization was carried out under controlled conditions at 65ºC, the reaction time set was 45 min for CHIKV and 1h for DENV, ZIKV control was included for verify specificity of DENV primers, the amplified products were visualized in agarose gel. The RT-LAMP assays were evaluated for duplicate in 95 acute plasma samples collected from patients with suspected DENV or CHIKV infection in Veracruz during September-October 2015. As gold standard, RT-qPCR assay was performed viii included all serotypes of DENV, ZIKV, CHIKV, Yellow Fever Virus (YFV) and West Nile Virus (WNV). Conventional RT-PCR and detection of IgM of DENV and CHIKV also performed in all the samples. The result by RT-LAMP and RT-qPCR assays for DENV were 2/95 positive samples, for CHIKV by RT-qPCR 41/95 positive samples were obtained for CHIKV and by RTLAMP were 45/95 positive samples, of which 13 / 95 are false positives and 9/95 are false negatives. The sensitivity and specificity of RT-LAMP assay for DENV was 100%, nonspecific hybridization no detected between DENV and ZIKV. For CHIKV sensitivity was 78% and specificity was 75% compared to the RT-qPCR assay. The IgM-DENV detection was found in 4/95 samples and IgM-CHIKV in 36/95 samples. Molecular and serological tests confirm CHIKV infection in 66/95 patients RT-LAMP assay demonstrated usefulness for detection DENV and CHIKV genome in patient samples, allowing the implementation of another tool for early diagnosis in low resource setting.
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