Construcción de un cósmido para la clonación y expresión de genes fúngicos Pubblico Deposited
Los vectores de clonación son moléculas de ADN que pueden ser mantenidas dentro de ciertas células hospederas, debido a que cuentan con elementos estructurales que les permiten replicarse de forma independiente al cromosoma. Estas moléculas artificiales tienen su origen en moléculas naturales de ADN encontradas en ciertos microorganismos, aunque el desarrollo de este tipo de vectores ha llevado a una cada vez mayor sofisticación. Hoy en día existe, de esta forma, una amplia gama de vehículos de clonación y expresión, entre los que se encuentran los plásmidos, bacteriófagos, cósmidos y cromosomas artificiales de bacterias, levaduras y mamíferos. Debido al gran tamaño de inserción que aceptan los cósmidos son atractivos para la elaboración de bibliotecas genómicas de microorganismos eucarióticos. Por ello, algunos cósmidos tienen, además del marcador de selección para Escherichia coli, un segundo marcador que les permite ser utilizado también en hongos o, sobre todo, en mamíferos. Son pocos, sin embargo, los cósmidos de este tipo existentes para hongos, por lo que su desarrollo aumentaría la posibilidad de investigación en biología molecular para este tipo de organismo. El cósmido IztapaCos, desarrollado a lo largo del presente trabajo, contiene una región de resistencia al antibiótico fleomicina (compuesta por el gen de resistencia ble de Streptoalloteichus hindustanus, el promotor del gen pcbC de Penecillium chrysogenum y la región terminadora de la transcripción del gen cycl de Saccharomyces cerevisiae), derivada del plásmido Pulc43 y que constituye el mecanismo de selección para hongos. El promotor del gen pcbC presente en este módulo de expresión fue modificado por mutagénesis dirigida para favorecer los procesos de construcción del nuevo cósmido, en concreto se eliminaron por este método los sitios de corte para las endonucleasas de restricción PstI y XbaI. El mismo plásmido Pulc43 aportó el marcador de selección para E. coli (resistencia a cloranfenicol). Las secuencias cos y el policonector, necesarias para la formación del cósmido final, se obtuvieron del cósmido comercial SuperCos® (Stratagene) mediante digestión con la endonucleasa de restricción PstI. Los elementos de interés se encontraron formando parte de un fragmento de 3.7 kpb. Para confirmar la funcionalidad de IztapaCos en hongos, se transformaron esporas pregerminadas de Penicillum chrysogenum por electroporación y se seleccionaron trransoformantes resistentes a fleomicina, lo que confirma que las modificaciones realizadas en el promotor del gen pcbC no afectan a la expresión del marcador de selección. La presencia de un marcador de selección dominante, como es el caso, hace de este cósmido un vector utilizable en un amplio rango de hongos filamentosos. Los vectores de clonación son moléculas de ADN que pueden mantenerse dentro de ciertas células huésped, ya que poseen elementos estructurales que les confieren la capacidad de replicarse fuera del cromosoma huésped. Estas moléculas artificiales se originan a partir de moléculas de ADN natural de microorganismos, aunque el desarrollo de este tipo de vectores dio origen a una mayor complejidad. Hoy en día podemos utilizar, de esta manera, una gran variedad de vectores de clonación y expresión, incluyendo plásmidos, fagos, cósmidos y cromosomas artificiales de bacterias, levaduras y mamíferos. Debido al gran tamaño de inserto que aceptarán los cósmidos, estos vectores son atractivos para crear bibliotecas genómicas a partir de microorganismos eucariotas. Para ello, algunos cósmidos poseen, además de un marcador selectivo para Escherichia coli, un segundo marcador para selección en hongos o, más frecuentemente, mamíferos. Existen pocos vectores de este tipo para hongos, y su desarrollo mejorará las posibilidades de investigación en Biología Molecular de dichos organismos. El cósmido IztapaCos, desarrollado a lo largo de este trabajo, contiene una región de resistencia al antibiótico fleomicina (compuesta por el gen de resistencia ble de Streptoalloteichus hindustanus, el promotor del gen pcbC de Penecillium chrysogenum y el terminador del gen cycl de Saccharomyces cerevisiae), derivada del plásmido pULC43. Esta región es la base del mecanismo de selección de este vector en hongos. El promotor del gen pcbC en este cassette fue modificado mediante mutagénesis dirigida para favorecer la construcción del nuevo cósmido. De esta manera, se eliminaron las secuencias de corte para las endonucleasas PstI y XbaI. El marcador de selección para E. coli, resistencia a cloranfenicol) también fue obtenido del plásmido pULC43. Las secuencias cos y el polienlazador para el nuevo cósmido se obtuvieron del cósmido comercial SuperCos® (Stratagene), después de la digestión de este vector con la endonucleasa PstI. Estos elementos estaban contenidos en un fragmento de 3,7 kb. Fragmento de PstI en el cósmido SuperCos®. Para demostrar la funcionalidad de los Iztapacos para la transformación fúngica, se electroporaron esporas pregerminadas de Penicillium chrysogenum. Se seleccionaron transformantes resistentes a la fleomicina, lo que confirma que las modificaciones realizadas en la secuencia del promotor pcbC no afectan la capacidad de expresión del marcador de selección. Este vector, que incluye un marcador de selección dominante, es un vector útil para una amplia gama de hongos filamentosos.
Cloning vectors are DNA molecules that can be maintained within certain host cells, because they have structural elements providing the ability to be replicated ouside of the host chromosome, These artificial molecules are originated from micro organisms´ natural DNA molecules, although the development of this kind of vectors originated a broader complexity. Today we can use, in this manner, a great variety of cloning and expression vectors, including plasmids, phages, cosmids and bacterial, yeast, and mammalian artificial chromosomes.Because the great insert´s size that cosmids will accept, these vectors are attractive to create genomic libraries from eukaryotic micro organisms. For this, some cosmids have, additionally to a selective marker for Escherichia coli, a second marker for selection in fungi or, more frequently, mammalians. There are few vectors of this kind for fungi, and its development will improve the possibility of research in Molecular Biology of such as organisms.IztapaCos, the cosmid, developed throughout this work, contains a region of resistance to the antibiotic phleomycin (composed of the ble resistance gene from Streptoalloteichus hindustanus, the promoter of the pcbC gene from Penecillium chrysogenum and the terminator from Saccharomyces cerevisiae cycl gene), derived from pULC43 plasmid. This region is the basis for the selection mechanism for this vector in fungi. The promoter of the pcbC gene in this cassette was modified by directed mutagenesis to favour the construction of the new cosmid. In this way, cutting sequences for endonucleasas PstI y XbaI were eliminated. Selectionmarker for E. coli, resistance to chloramphenicol) was also obtained from pULC43 plasmid. Cos sequences, and polylinker for the new cosmid were obtained from commercial cosmid SuperCos® (Stratagene), after digestion of this vector with endonuclease PstI. These elements were contained into a 3.7 kb PstI fragment in SuperCos® cosmid. To demonstrate the Iztapacos´ functionality for fungal transformation, pregerminated spores from Penicillium chrysogenum were electroporated. Phleomycin-resistant transformants were selected, confirming that modifications made on the sequence of pcbC promoter do not affect the ability of the selection marker expression. This vector, including a dominant selection marker, is a useful vector for a wide range of filamentous fungi.
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