Estudios sobre Regulación Epigenética del Metabolismo Secundario en Penicillium chrysogenum Public Deposited
Los hongos filamentosos tienen un gran potencial para producir moléculas bioac-tivas, muchas de ellas de inter ́es para la industria farmacéutica, como por ejemplo antibióticos y antitumorales. Por ello resulta de gran inter ́es la búsqueda declusters del metabolismo secundario que sinteticen nuevos productos naturales. Sin embargo, frecuentemente estos clúster no se expresan en las condiciones habituales de cultivo en laboratorio, y en consecuencia no se sintetizan los compuestos a los que darían lugar. Estos clúster que no se expresan habitualmente se denominan “clúster silentes”, y los compuestos que sintetizan suelen denominarse “crípticos”. El silenciamiento declus-tersdel metabolismo secundario se sabe que depende principalmente de mecanismos de regulación Epigenética. Se conoce como Minería Genómica (Genome Mining) a la búsqueda de nuevas enzimas y productos a partir de la información suministrada por la secuencia de un ge-noma. En el campo del metabolismo secundario comprende un conjunto de estrategias encaminadas a la búsqueda de nuevos clúster, su expresión y la obtención de nuevos metabolitos secundarios. El objetivo de este estudio fue emplear algunas estrategias de Minería Genómica para la manipulación de la regulación Epigenética en P. chrysogenum. NRRL 1951, y provocar cambios en el perfil de metabolitos secundarios producidos. De igual forma, se realizó un análisis para la predicción de clústeres involucrados en el me-tabolismo secundario mediante el análisis del genoma del hongo utilizando el programa bioinformático anti SMASH. Una parte de este trabajo consintió en la aplicación de distintas concentraciones de dos compuestos remodeladores de la cromatina: 5-azacitidina (inhibidor de DNA metiltransferasas) y tricostatina A (inhibidor de histonas desacetilasas), a medios de cultivo líquidos de P. chrysogenum. Uno de los medios utilizados fue el medio definido MDFP y otro el medio complejo PDB. A continuación los extractos obtenidos se analizaron por LC-MS, y los perfiles cromatógrafos generados fueron examinados con el programa MZmine2, que permitió evidenciar la aparición de cambios en el perfil de metabolitos secundarios en todas las condiciones utilizadas. Se produjeron cambios de manera más significativa en el medio PDB con la concentración de 250μM de 5-azacitidina y 1μM de tricostatina A. Se utilizaron además técnicas moleculares para modificar la regulación Epigenética. Se construyó un vector para el silenciamiento por medio de la vía RNAi (RNA inter-ferente) del gen cclA, cuyo producto hace parte del complejo COMPASS, un efector transcripcional que actúa favoreciendo el estado de heterocromatina. Con este vector de silenciamiento se obtuvieron ocho cepas transformantes de P. chrysogenum, que fueron analizadas mediante PCR para confirmar la integración del vector. Finalmente, se llevó a cabo un análisis con el software bioinformático anti SMASH de la secuencia genómica de P. chrysogenum Wisconsin 54-1255, con el objeto de predecir clúster del metabolismo secundario, dando como resultando un aumento con-siderable en el número y clase de compuestos predichos en comparación con un estudio previamente realizado en este hongo con otro programa. En resumen, en el presenten estudio se pusieron a punto varias estrategias comple-mentarias con el propósito de encontrar nuevos compuestos bioactivos producidos por. Chrysogenum.
Filamentous fungi have a great potential to produce bioactive molecules, many of them of interest to the pharmaceutical industry, such as antibiotics and antitumor agents. It is therefore of great interest to search for clusters of secondary metabolism to synthesize new natural products. However, often these clusters are not expressed under conditions of cultivation in the laboratory, and consequently the compounds that these clusters might produce are not synthetized. Clusters that are not expressed are kown as “silent clusters”, and the compounds that they potentially may synthesize are usually called “cryptic”. The silencing of secondary metabolism clusters is known that depends mainly on epigenetic regulatory mechanisms. The concept of Genome Mining refers to the search of new enzymes and products on the basis of the information provided by the sequence of a genome. In the field of secondary metabolism genome mining comprises a set of strategies for the search of new biosynthetic clusters, their expression and the isolation and identification of new secondary metabolites. The objective of this study was to assay some genome mining strategies for the manipulation of the epigenetic regulation in P. chrysogenum NRRL 1951, and thus cause changes in the profile of the secondary metabolites produced. Si- milarly, a bioinformatic analysis was carried out for the prediction of clusters involved in secondary metabolism through the analysis of the P. chrysogenum genome using the program antiSMASH. A part of this work was the application of different concentrations of two chromatin remodeling compounds: 5-azacitidine (DNA methyltransferase inhibitor) and trichosta- tin A (histone deacetylase inhibitor), to liquid cultures of P. chrysogenum . One of the media used was the defined MDFP medium, and the other the complex PDB medium. The extracts obtained from the filtrated broths were analyzed by LC-MS, and chromatographic profiles generated were examined with the program MZmine2, which allowed to detect the appearance of changes in the profile of secondary metabo- lites produced in all conditions tested. The most significant changes in the profile of secondary metabolites occurred in the PDB medium with a concentration of 250 μ M of 5-azacitidine and 1 μ M of trichostatin A. Molecular techniques were also used to modify the epigenetic regulation. A vector was constructed for gene silencing via the RNAi pathway (interfering RNA) of the cclA gene, whose product is part of the COMPASS complex, a transcriptional regulator that acts inducing formation of heterochromatin. Eight transformant strains were obtained with this silencing vector, which were analyzed by PCR to confirm the integration of the vector in the genome. Finally, an analysis of the P. chrysogenum Wisconsin 54-1255 genome was carried out with the bioinformatic software antiSMASH, in order to predict secondary meta- bolism clusters. The results showed a considerable increase in the number and class of clusters and predicted compounds in comparison to a study previously conducted in this fungus with other programs. In summary, in this work different complementary strategies of genome mining were set with the purpose of finding new bioactive compounds produced by P. chrysogenum.
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