Aislamiento de polifenol oxidasa para la melanización de polifenoles extraíbles y no extraíbles de Amaranthus hypochondriacus L. y Pleurotus ostreatus Público Deposited
Todo esto se realizó para la optimización de las condiciones para tener una mayor concentración de polifenoles liberados y listos para ser utilizados como sustrato de los extractos crudos ya obtenidos anteriormente. Todo esto fue analizado por el método de superficie de respuesta teniendo como variables explicativas la temperatura de reacción, el tiempo de reacción y la concentración de disolvente o ácido, según la metodología empleada. La variable respuesta en todos los casos fue la concentración de polifenoles por cada gramo de muestra. Para este análisis, a diferencia del experimento anterior, fueron harina de rastrojo de amaranto y de hongo deshidratado con el tamaño de partícula lo más uniforme posible. Para la harina hecha con el rastrojo de amaranto se obtuvieron 19.95 ± 0.922 mg de ácido gálico/g de muestra de polifenoles extraíbles polares con 55% ± 1% v/v de metanol, 36° ± 1.8 °C de temperatura de reacción y a los 42.9 ± 0.9 min. Para los polifenoles con polaridad intermedia se tuvo un valor máximo de 8.838 ± 0.422 mg de ácido gálico/g de muestra con 37.56% ± 2.1% v/v de acetona, 20° ± 0.96°C a 41.5 ± 0.987 min. Para los polifenoles no extraíbles el valor máximo obtenido fue de 102.084 ± 2.453 mg de ácido gálico/g de muestra con una solución de 5% ± 0.04% v/v de ácido sulfúrico, 90° ± 1.37°C y a 103.437 ± 2.13 min. Para la harina hecha con P. ostreatus deshidratado su contenido de polifenoles extraíbles polares alcanzo un valor de 1.695 ± 0.043 mg de ácido gálico/g de muestra con 90% ± 3% v/v de metanol, 50° ± 1.2°C a 20.9 ± 1.01 min. Para los polifenoles con polaridad intermedia se obtuvieron 1.006 ± 0.013 mg de ácido gálico/g de muestra con 8.76% ± 0.07% v/v de acetona, 18° ± 1.67 °C a 36.16 ± 1.6 min. Finalmente, para los polifenoles no extraíbles se alcanzó la concentración de 6.823 ± 0.467 mg de ácido gálico con 8.03% ± 0.01% v/v de ácido sulfúrico, 90° ± 2.57 °C y a los 97 ± 2.21 min. Todos los modelos fueron significativos con un valor P menor a 0.05 teniendo significancia todos los factores. La síntesis de melanina utilizando los polifenoles extraídos y liberados de las matrices alimentarias no se pudo llevar a cabo por que no se tuvo accesibilidad a la planta piloto debido a la pandemia por el Sars cov 2 en el año en curso; sin embargo durante las mediciones de la actividad enzimática de los extractos crudos con actividad polifenol oxidasa se sintetizaron compuestos de color oscuro, dependiendo del polifenol utilizado como sustrato la síntesis de pigmentos oscuros tomó un tiempo mayor o menor. En el caso de la tirosina, en un vaso destapado, ya se presentaba una coloración oscura a los 3 días, mientras que con el catecol tardó entre 4 o 5 días, y con la rutina tomó semana y media, la aparición de dicha coloración. A estos pigmentos oscuros de les realizaron dos pruebas rápidas; la solubilidad en álcali y la precipitación en medio ácido, que cumplieron con los requisitos para determinar que el contenido de los vasos eran melaninas. Esto coincide con los ensayos realizados por Mondal y Murniati en 2018.
All this was analyzed by the response surface method, taking as explanatory variables the reaction temperature, the reaction time and the concentration of solvent or acid according to the methodology used, and the response variable in all cases was the concentration of polyphenols per Each gram of sample, for this analysis, unlike the previous experiment, was amaranth stubble flour and dehydrated mushroom with the most homogeneous particle size possible, approximately 420 µm. For the flour made with amaranth stubble, 19.95 ± 0.922 mg of gallic acid / g of sample of polar extractable polyphenols were obtained with 55% ± 1% v / v of methanol, 36 ° ± 1.8 ° C of reaction temperature and at 42.9 ± 0.9 min. For polyphenols with intermediate polarity there was a maximum value of 8.838 ± 0.422 mg of gallic acid / g of sample with 37.56% ± 2.1% v / v of acetone, 20 ° ± 0.96 ° C and at 41.5 ± 0.987 min. For non-extractable polyphenols the maximum value obtained was 102.084 ± 2.453 mg of gallic acid / g of sample with a solution of 5% ± 0.04% v / v of sulfuric acid, 90 ° ± 1.37 ° C and at 103.437 ± 2.13 min. For flour made with dehydrated P. ostreatus, its content of extractable polar polyphenols reached a value of 1,695 ± 0.043 mg of gallic acid / g of sample with 90% ± 3% v / v of methanol, 50 ° ± 1.2 ° C and at 20.9 ± 1.01 min. For polyphenols with intermediate polarity, 1.006 ± 0.013 mg of gallic acid / g of sample were obtained with 8.76% ± 0.07 % v / v of acetone, 18 ° ± 1.67 ° C and at 36.16 ± 1.6 min. Finally, for non-extractable polyphenols the concentration of 6.823 ± 0.467 mg of gallic acid with 8.03% ± 0.01% v / v of sulfuric acid, 90 ° ± 2.57 ° C and at 97 ± 2.21 min. All the models were significant with a P value less than 0.05, all the factors having significance. The synthesis of melanin using the polyphenols extracted and released from the food matrices could not be carried out because there was not accessibility to the pilot plant, due to the Sars cov 2 pandemic in the current year. However, during the measurements of the enzimatic activity of the crude extracts with polyphenol oxidase activity, dark colored compounds were synthesized, depending on the polyphenol used as substrate; the synthesis of dark pigments took a longer or shorter time. In the case of tyrosine, in an uncovered glass, a dark coloration was already present at 3 days; while with catechol it took between 4 or 5 days, and with the routine it took a week and a half, the appearance of said coloration.
Melanins are polymers of oxidized indoles present in a large part of living beings on the planet, in mammals they are responsible for giving color to hair, eyes and skin, while in plants and fungi they are the result of enzymatic darkening, something that in agro-industrial products is not wanted. These molecules have a high complexity in their chemical structure, for this reason they have not been studied as thoroughly as other compounds present in living organisms. However, there are studies where it has been proven that these have properties that could have favorable results on human health, such as antioxidant activity, the chelating effect of some metals, their ability to precipitate proteins, and their capacity as an electrical semiconductor in biomedical equipment among others. These compounds are already used in the cosmetic and food industry as dark pigments in different products. In this project we worked with two food matrices from which the polyphenols as the substrate of the enzyme and the crude enzymatic extracts with polyphenol oxidase activity were isolated. For both of which the conditions to get the better synthesis of melanins were sought. The first is a plant, Amaranthus hypochondriacus L., different parts of this plant such as the leaves, the stem of the fresh plant and the so called stubble, the waste product of the harvest of the amaranth, were analized. On the other hand, the mushroom, Pleourotus ostreatus was used, of which the same tests were made. In the case of crude extracts with polyphenol oxidase activity, tests were carried out with three different substrates, examples of common polyphenols within foods such as tyrosine, catechol and rutin; with these the crude extracts with polyphenol oxidase activity obtained were compared. from different parts of the plant, first the leaves, the stem, the stem with the leaves and the stubble, while the mushroom was evaluated dehydrated and fresh. The crude extract that showed the highest kinetic parameters with all substrates and consequently the one that could be considered the best was obtained from the fresh mushroom, this is because its kinetic parameters such as reaction speed were the highest with the catechol where Vmax was 33.333 ± 0.032 µmol / (mL s) and Km was 96.3 ± 0.5 µmol. In all cases, when performing the Tukey test, the data gave sufficient proof that the set was independent and had a significant difference with a P value P<0.05. The extraction of phenolic compounds was carried out from these food products, both the extractable polyphenols and the non-extractable polyphenols were extracted using organic solvents such as methanol and acetone in different concentrations in the case of the liberation of the extractables while for the nonextractable polyphenols, an acid hydrolysis of the cell wall was carried out with different concentrations of sulfuric acid, all this for the optimization of the conditions to have a higher concentration of polyphenols released and ready to be used as a substrate for the crude extracts already previously obtained.
Las melaninas son polímeros de indoles oxidados presentes en gran parte de los seres vivos del planeta, en mamíferos son las responsables de dar color al pelo, ojos y piel, mientras que en plantas y hongos son el resultado del oscurecimiento enzimático, algo que en los productos agroindustriales no es deseado. Estas moléculas tienen una alta complejidad en su estructura química, por este motivo no han sido estudiadas tan a fondo. Sin embargo, existen estudios en donde se ha probado que éstos poseen propiedades que podrían tener resultados favorecedores en la salud humana como lo son la actividad antioxidante, el efecto quelante de algunos metales, su capacidad para precipitar proteínas, su capacidad como semiconductor eléctrico en equipos biomédicos entre otras, estos compuestos ya son utilizadas en la industria cosmética y alimenticia como pigmento oscuro en diferentes productos. En este proyecto se trabajó con dos productos agroindustriales de los cuales se buscaron las condiciones para aislar los polifenoles y que funcionen como el sustrato de los extractos crudos enzimáticos con actividad polifenol oxidasa, en ambos casos se buscaron las condiciones óptimas que nos permitieran tener una mejor síntesis de las melaninas. El primero es una planta, Amaranthus hypochondriacus L., se analizaron distintas partes de dicha planta como las hojas, el tallo de la planta fresca y rastrojo, que es el producto de desecho de la cosecha del amaranto, por otro lado, se utilizó el hongo, Pleourotus ostreatus, del que se hicieron las mismas pruebas. Para el caso de los extractos crudos con actividad polifenol oxidasa se hicieron pruebas con tres distintos sustratos, ejemplos de polifenoles comunes dentro de alimentos como lo son la tirosina, el catecol y la rutina, con los que fueron comparados los extractos crudos con actividad polifenol oxidasa obtenidos de diferentes partes de la planta, primero las hojas, el tallo, el tallo con las hojas y el rastrojo, mientras que del hongo se evaluó deshidratado y fresco. El extracto crudo que mostró los parámetros cinéticos más elevados con todos los sustratos y, en consecuencia, el que se podría considerar como el mejor fue el obtenido del hongo fresco teniendo una velocidad mayor con el catecol como sustrato, siendo esta de 33.333 ± 0.032 µmol/ (mL s) con una Km fue de 96.3 ± 0.5 µmol. Posteriormente en todos los casos se realizó una prueba de Tukey para comparar y agrupar las medias de velocidad y en esta los datos dieron prueba suficiente de que el conjunto era independiente y tenía diferencia significativa con un valor P<0.05. De igual forma se realizó una extracción de compuestos fenólicos en los productos agroalimentarios, se extrajeron tanto los polifenoles extraíbles y se liberaron los no extraíbles utilizando disolventes orgánicos como el metanol y la acetona en diferentes concentraciones para los extraíbles; mientras que para los polifenoles no extraíbles se llevó a cabo una hidrólisis ácida de la pared celular con distintas concentraciones de ácido sulfúrico.
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