Obtención de ácido clorogénico de la pulpa de café a partir de extractos enzimáticos producidos por fermentación en medio sólido Pubblico Deposited
México es un importante productor a nivel mundial de café. Los residuos como la pulpa de café, pueden ser tratados mediante procesos biotecnológicos, para evitar problemas ambientales y obtener compuestos de alto valor agregado, contribuyendo a mejorar la situación socioeconómicos de este sector agroindustrial. En esta tesis se estudió la extracción del ácido clorogénico esterificado a la pared celular de la pulpa de café mediante extractos enzimáticos producidos por fermentación en medio sólido (FMS). Los resultados están organizados en cuatro bloques: a) Desarrollo de metodología (enzimática y de respirometría), b) Pre-selección y selección de cepas, c) Estudio del efecto de las enzimas despolimerizantes sobre la obtención del ácido clorogénico y d) Optimización de la producción de extractos enzimáticos para la obtención del ácido clorogénico. Se desarrollaron y evaluaron diversas técnicas analíticas para la cuantificación de la actividad pectinasa, xilanasa y celulasa en cajas de Petri y la cuantificación de la actividad clorogenato esterasa por espectrofotometría. Se desarrolló un sistema para la medición en línea del CO2 (%) producido, O2 (%) consumido y el flujo (ml/min) durante la FMS. El sistema permitió obtener datos confiables y reproducibles. El sistema desarrollado esta en proceso de registro para patente. Se estudiaron 6 cepas de hongos filamentosos A. niger (A10 y CH4), A. tamarii, R. pusillus, Trametes sp. y Trichoderma harzianum. Los extractos enzimáticos producidos por FMS de R. pusillus y Trametes sp. presentaron la mayor capacidad para extraer el ácido clorogénico (17%) y la menor capacidad para hidrolizar el ácido clorogénico del medio. La mezcla de los extractos crudos producidos por estas dos cepas con la pectinasa comercial extrajeron el 68% del ácido clorogénico. Se determinó que la presencia de enzimas despolimerizantes, era necesaria para realizar la extracción del ácido clorogénico. Con una metodología de diseño de mezclas se determinó que la presencia de las actividades pectinolítica (APec) y xilanolítica (AXil) tiene un efecto importante en la extracción del ácido clorogénico. Los intervalos donde se presentó la zona de máxima extracción de ácido clorogénico esterificado fue (U/g PC): 60 ≤ AXil ≤ 150, 50 ≤ APec ≤ 140, 0 ≤ ACel ≤ 40. El rendimiento obtenido por las enzimas comerciales pectinasa y xilanasa (69%) fue similar al obtenido con la mezcla de los extractos crudos de R. pusillus y Trametes sp. producidos por FMS adicionando la pectinasa comercial (68%).
Se optimizaron las condiciones de cultivo para producir las enzimas despolimerizantes por FMS de R. pusillus, utilizando diseños experimentales. Con el diseño experimental tipo PlackettBurman se identificó que la concentración de sacarosa, (NH4)2SO4, (NH4)2HPO4 y la temperatura tienen un efecto positivo sobre la producción de APec y AXil. Mientras que la concentración de sacarosa, (NH4)2SO4 y (NH4)2HPO4 tienen un efecto negativo sobre la enzima clorogenato esterasa (ClE) responsable de hidrolizar el ácido clorogénico a ácido cafeico y ácido quínico. Los perfiles de actividad enzimática de la pectinasa, xilanasa y ClE mostraron que la mayor actividad de la ClE se presentó 4 horas después de presentarse la mayor APec y AXil. A través de un diseño factorial central compuesto se determinó que los intervalos donde se presentó la zona de mayor APec y AXil fueron (g/100 g SS): 5 ≤ Sacarosa ≤ 6, 2 ≤ (NH4)2SO4 ≤ 3.3 y 2.1 ≤ (NH4)2HPO4 ≤ 2.9 y la menor actividad de la ClE fueron (g/100 g SS): 5.4 ≤ Sacarosa ≤ 7.5, 2.5 ≤ (NH4)2SO4 ≤ 4, 2.5 ≤ (NH4)2HPO4 ≤ 4. Se observó un posible efecto de represión catabólica a concentraciones mayores de sacarosa de 6 g/100 g sobre las actividades pectinolítica y xilanolítica. Mientras que la actividad de la clorogenato esterasa disminuyó conforme aumentaba el nivel de sacarosa en el medio de cultivo. Por último se evaluó la extracción del ácido clorogénico con el extracto enzimático crudo de R. pusillus producido por FMS con las condiciones optimizadas de cultivo (g/100 g SS): sacarosa, 5.5; (NH4)2SO4, 2.8 y (NH4)2HPO4, 2.6. El rendimiento de extracción del ácido clorogénico con el extracto crudo de R. pusillus fue del 69%. Este rendimiento fue similar al obtenido con las dos enzimas comerciales pectinasa y xilanasa y a la mezcla de la pectinasa comercial con los extractos crudos de R. pusillus y Trametes sp. producidos por FMS. La evidencia experimental presentada en este trabajo mostró el potencial de extraer compuestos de alto valor agregado como el ácido clorogénico esterificado a la pared celular de la pulpa de café a partir de extractos enzimáticos crudos producidos por FMS.
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