Obtención de ácido clorogénico de la pulpa de café a partir de extractos enzimáticos producidos por fermentación en medio sólido Público Deposited
México es un importante productor a nivel mundial de café. Los residuos como la pulpa de café, pueden ser tratados mediante procesos biotecnológicos, para evitar problemas ambientales y obtener compuestos de alto valor agregado, contribuyendo a mejorar la situación socioeconómicos de este sector agroindustrial. En esta tesis se estudió la extracción del ácido clorogénico esterificado a la pared celular de la pulpa de café mediante extractos enzimáticos producidos por fermentación en medio sólido (FMS). Los resultados están organizados en cuatro bloques: a) Desarrollo de metodología (enzimática y de respirometría), b) Pre-selección y selección de cepas, c) Estudio del efecto de las enzimas despolimerizantes sobre la obtención del ácido clorogénico y d) Optimización de la producción de extractos enzimáticos para la obtención del ácido clorogénico. Se desarrollaron y evaluaron diversas técnicas analíticas para la cuantificación de la actividad pectinasa, xilanasa y celulasa en cajas de Petri y la cuantificación de la actividad clorogenato esterasa por espectrofotometría. Se desarrolló un sistema para la medición en línea del CO2 (%) producido, O2 (%) consumido y el flujo (ml/min) durante la FMS. El sistema permitió obtener datos confiables y reproducibles. El sistema desarrollado esta en proceso de registro para patente. Se estudiaron 6 cepas de hongos filamentosos A. niger (A10 y CH4), A. tamarii, R. pusillus, Trametes sp. y Trichoderma harzianum. Los extractos enzimáticos producidos por FMS de R. pusillus y Trametes sp. presentaron la mayor capacidad para extraer el ácido clorogénico (17%) y la menor capacidad para hidrolizar el ácido clorogénico del medio. La mezcla de los extractos crudos producidos por estas dos cepas con la pectinasa comercial extrajeron el 68% del ácido clorogénico. Se determinó que la presencia de enzimas despolimerizantes, era necesaria para realizar la extracción del ácido clorogénico. Con una metodología de diseño de mezclas se determinó que la presencia de las actividades pectinolítica (APec) y xilanolítica (AXil) tiene un efecto importante en la extracción del ácido clorogénico. Los intervalos donde se presentó la zona de máxima extracción de ácido clorogénico esterificado fue (U/g PC): 60 ≤ AXil ≤ 150, 50 ≤ APec ≤ 140, 0 ≤ ACel ≤ 40. El rendimiento obtenido por las enzimas comerciales pectinasa y xilanasa (69%) fue similar al obtenido con la mezcla de los extractos crudos de R. pusillus y Trametes sp. producidos por FMS adicionando la pectinasa comercial (68%). Se optimizaron las condiciones de cultivo para producir las enzimas despolimerizantes por FMS de R. pusillus, utilizando diseños experimentales. Con el diseño experimental tipo PlackettBurman se identificó que la concentración de sacarosa, (NH4)2SO4, (NH4)2HPO4 y la temperatura tienen un efecto positivo sobre la producción de APec y AXil. Mientras que la concentración de sacarosa, (NH4)2SO4 y (NH4)2HPO4 tienen un efecto negativo sobre la enzima clorogenato esterasa (ClE) responsable de hidrolizar el ácido clorogénico a ácido cafeico y ácido quínico. Los perfiles de actividad enzimática de la pectinasa, xilanasa y ClE mostraron que la mayor actividad de la ClE se presentó 4 horas después de presentarse la mayor APec y AXil. A través de un diseño factorial central compuesto se determinó que los intervalos donde se presentó la zona de mayor APec y AXil fueron (g/100 g SS): 5 ≤ Sacarosa ≤ 6, 2 ≤ (NH4)2SO4 ≤ 3.3 y 2.1 ≤ (NH4)2HPO4 ≤ 2.9 y la menor actividad de la ClE fueron (g/100 g SS): 5.4 ≤ Sacarosa ≤ 7.5, 2.5 ≤ (NH4)2SO4 ≤ 4, 2.5 ≤ (NH4)2HPO4 ≤ 4. Se observó un posible efecto de represión catabólica a concentraciones mayores de sacarosa de 6 g/100 g sobre las actividades pectinolítica y xilanolítica. Mientras que la actividad de la clorogenato esterasa disminuyó conforme aumentaba el nivel de sacarosa en el medio de cultivo. Por último se evaluó la extracción del ácido clorogénico con el extracto enzimático crudo de R. pusillus producido por FMS con las condiciones optimizadas de cultivo (g/100 g SS): sacarosa, 5.5; (NH4)2SO4, 2.8 y (NH4)2HPO4, 2.6. El rendimiento de extracción del ácido clorogénico con el extracto crudo de R. pusillus fue del 69%. Este rendimiento fue similar al obtenido con las dos enzimas comerciales pectinasa y xilanasa y a la mezcla de la pectinasa comercial con los extractos crudos de R. pusillus y Trametes sp. producidos por FMS. La evidencia experimental presentada en este trabajo mostró el potencial de extraer compuestos de alto valor agregado como el ácido clorogénico esterificado a la pared celular de la pulpa de café a partir de extractos enzimáticos crudos producidos por FMS.
Mexico is an important coffee producer in the world. The wastes as coffee pulp can be treated by biotechnological processes to avoid environmental problems and to obtain high added value compounds, contributing to improve the socio-economic situation of this agroindustrial sector. In this work was studied the extraction of chlorogenic acid esterified to cell wall coffee pulp by enzyme extracts produced by solid-state fermentation (SSF). The results are organized on four sections: a) Development of methodology (enzymatic and respirometry), b) Pre-selection and selection of strains, c) Study of the effect of depolymerizing enzymes on obtaining of chlorogenic acid and d) Optimization of production of enzyme extracts to obtained chlorogenic acid. We developed and evaluated different analytical techniques for quantifying of pectinase, xylanase and cellulase activities in Petri dishes and the quantification of chlorogenate esterase activity by spectrophotometry. We developed a system for online measurement of CO2 (%) produced, O2 (%) consumed and flow (ml / min) during SSF. This system allows obtaining good quality and reproducible data. System developed is in procces for patent registration. Six strains from filamentous fungal were used including A. niger (A10 and CH4), A. tamarii, R. pusillus, Trametes sp. and Trichoderma harzianum. The enzymatic extracts by R. pusillus and Trametes sp produced by SSF were able to extract the highest concentration of chlorogenic acid (17%) and able to hydrolyze the lowest concentration of chlorogenic acid. The mixtures of crude extracts produced by these two strains added with commercial pectinase extracted 68% of chlorogenic acid. It was determined that the presence of depolymerizing enzymes (pectinase), are necessary for extraction of chlorogenic acid. With a mixture design methodology it was determined that the presence of pectinolytic (APec) and xylanolytic (AXil) activities have an important effect on the extraction of chlorogenic acid. The intervals in where it was presented the zone of higher extraction of chlorogenic acid esterified for the 3 enzymatic activities were (U / g PC): 60 ≤ AXil ≤ 150, 50 ≤ APec ≤ 140, 0 ≤ ACel ≤ 40. The yield obtained by commercial pectinase and xylanase (69%) was similar to that obtained with the mixture of the crude extracts by R. pusillus and Trametes sp. produced by SSF with commercial pectinase (68%). The culture conditions for production by SSF the depolymerizing enzymes by R. pusillus were optimized with experimental design. Experimental design type Plackett-Burman, allow to identify that the concentration of sucrose, (NH4)2SO4, (NH4)2HPO4 and temperature have a positive effect on the APec and AXil. While, the concentration of sucrose, (NH4)2SO4, (NH4)2HPO4 have a negative effect on the production of chlorogenate esterase (ClE), this enzyme hydrolyzed the chlorogenic acid to caffeic and quinic acids. The enzymatic activity profiles of pectinase, xylanase and ClE showed that the higher ClE activity was presented four hours after that the higher APec and AXil. Central composite factorial design allow to identify that the intervals where appears the zone of higher APec and AXil were (g/100 g SS): 5 ≤ Sucrose ≤ 6, 2 ≤ (NH4)2SO4 ≤ 3.3 and 2.1 ≤ (NH4)2HPO4 ≤ 2.9 and the intervals where presented the zone of lower CIE activity were (g/100 g SS): 5.4 ≤ Sucrose ≤ 7.5, 2.5 ≤ (NH4)2SO4 ≤ 4, 2.5 ≤ ((NH4)2HPO4 ≤ 4. It was observed a possible effect of catabolism repression on pectinolytic and xylanolytic activities in the assays that showed the highest concentration of sucrose 6 g/100 g. While, by other side, chlorogenate esterase activity decreased in the assays that showed the highest concentration of sucrose in the culture medium. Finally, it was evaluated the extraction of chlorogenic acid by crude enzymatic extract by R. pusillus produced by SSF. The culture conditions were as follows (g/100 g SS): sucrose, 5.5; (NH4)2SO4, 2.8 and (NH4)2HPO4, 2.6. The extraction yield of chlorogenic acid with this extract was 69%. This extraction yield was similar to that obtained with the preparation of two commercial pectinase and xylanase and the mixture of the crude enzymatic extracts by R. pusillus and Trametes sp. produced by SSF with a commercial pectinase. Experimental evidence presented in this work showed the potential of extracting highvalue compounds such as esterified chlorogenic acid to the cell wall of coffee pulp by crude enzymatic extracts produced by SSF.
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