Determinación de la distribución de balsas lipídicas (lipid rafts) y cuantificación del colesterol de la membrana de espermatozoides criopreservados de cerdo Public Deposited
El proceso de fertilización se caracteriza por una serie de eventos que ocurren tanto en el ovocito como en el espermatozoide, que conducen a la formación del cigoto y finaliza con la formación de un nuevo individuo. Los espermatozoides deben pasar por una serie de eventos moleculares, llamados globalmente capacitación. Este proceso involucra el reordenamiento de lípidos y proteínas, cambios en la permeabilidad de iones y la fosforilación de muchas proteínas, así como, la pérdida de colesterol que provoca la reorganización de las balsas lipídicas. Durante la criopreservación, los espermatozoides disminuyen su capacidad fertilizante, esto se ha relacionado con alteraciones en la membrana plasmática. Los espermatozoides de cerdo presentan, hasta la fecha, la mayor dificultad en preservarse. Este efecto se ha relacionado con la composición lipídica de la membrana plasmática. Solo el 2.5 % de los espermatozoides criopreservados conservan su funcionalidad completa (viabilidad, movilidad, morfología y capacidad de fertilización). El objetivo de este trabajo fue determinar el efecto de la criopreservación sobre la distribución de las balsas lipídicas y sobre la concentración de colesterol en la membranade espermatozoides de cerdo. Para determinar los cambios que se presentan en la distribución de balsas lipídicas de espermatozoides de cerdo sometidos a criopreservación, se utilizó la toxina de cólera unido a fluoresceína (CTX-FTC), como marcador del GM1, glucósido que se encuentra acoplado a las balsas lipídicas, comparándolos con las muestras antes de ser criopreservadas y con espermatozoides que se capacitaron in vitro. Encontrándose 5 patrones de distribución de fluorescencia: A: en flagelo y cabeza, B:intensa en la cabeza pero débil en el flagelo, B1: intensa en la cabeza destacando un anillo semicircular y débil en el flagelo, C:intensa en la cabezay D: en la región post-acrosomal de la cabeza y pieza intermedia del flagelo. Las medias para el porcentaje de los patrones encontrados en espermatozoides no capacitados fueron A el 88.7, B el 6.3 y C 5; capacitadosin vitro A el 5.5, B el 22.7 y C 71.8; criopreservados A el57.8, B el 13.9, B1 el 1.7, C el 17.1 y D 9.5. Del análisis de concentración de colesterol de la membrana plasmática utilizando el kit Amplex Red, se encontraron 183.6 µg/ml en espermatozoides no capacitados,147.6 µg/ml en espermatozoides capacitados (p˂0.005), mientras que en el grupo de criopreservados el colesterol solo se encontró en el medio de congelación 487.9 µg/ml. El proceso de criopreservación daña la membrana plasmática de los espermatozoides, provocando la migración de las balsas lipídicas hacia la cabeza del espermatozoide y causa una pérdida importante de colesterol de la membrana plasmática, incrementando enlos espermatozoides capacitados. Sin embargo se requieren otros estudios complementarios tales como análisis de movilidad asistido por computadora, ensayos de reacción acrosomaly cuantificar decolesterol en balsas lipídicas aisladas.
The process of fertilization is characterized by a series of events that occur in both the oocyte and the sperm, which lead to the formation of the zygote and ends with the formation of a new individual. Sperm must undergo a series of molecular events, called capacitation globally. This process involves the reorganization of lipids and proteins, changes in ion permeability and phosphorylation of many proteins and a reorganization of the plasma membrane domains called lipid rafts, cholesterol and loss of plasma membrane not that rafts. During cryopreservation sperm fertilizing capacity decrease there has been linked to alterations in the plasma membrane. Boar sperm have, to date, the greatest difficulty in preserving. This effect has been related to the lipid composition of the plasma membrane. Only 2.5% of cryopreserved sperm retain their full functionality (viability, motility, morphology and fertilizing capacity). The aim of this study was to determine the effect of cryopreservation on the distribution of lipid rafts and cholesterol concentration in the membrane of boar sperm. To determine the changes that occur in the distribution of lipid rafts of boar spermatozoa undergo cryopreservation, the cholera toxin bound to fluorescein (CTX-FTC), a marker of GM1, glucose that is coupled to the lipid rafts used, comparing the samples before and cryopreserved sperm that were trained in vitro. Finding three fluorescence patterns: A: flagellum and head, B: Fluorescence labeled weak in the head but in the flagellum and C: fluorescence in the acrosomal region and postacrosomal and absence in the flagellum. Sperm non-capacitatedA 88.7%, B 6.3% and C 5%; capacitated A 5.5%, B 22.7% and C 71.8%; cryopreserved A 57.8%, B 13.9% and C 17.1%. Analysis of concentration of plasma membrane cholesterol using the Amplex Red kit, 183.6 µg/ml were found in non-capacitated sperm, 147.6 µg/ml in capacitated sperm, while in the cryopreserved group of cholesterol is only found in the middle freezing 487.9 µg/ml. The cryopreservation damages the sperm plasma membrane, causing a slight increase in lipid rafts migration towards the sperm head and the loss of plasma membrane cholesterol, increasing the capacitated sperm. More studies are needed that complement our results by determining the difference in mobility using a computerized system, which would provide a more objective analysis; RA evaluate training and chlortetracycline and assays with Coomassie to determine whether the value of the position of the lipid rafts, performed here by tracking GM1, correlates with these processes and quantifying cholesterol in isolated lipid rafts, to determine is the proportion that is anchored to them.
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