Estudio de la producción de β-N-acetilglucosaminidasas e hidrofobinas en cultivo sumergido de Lecanicillium lecanii Pubblico Deposited
Lecanicillium lecanii es un hongo entomopatógeno utilizado comercialmente como una alternativa de biocontrol en agricultura y horticultura. Dentro del proceso de infección se producen enzimas y proteínas tales como quitinasas, proteasas, lipasas e hidrofobinas. En la clasificación de las quitinasas se encuentran las β-N-acetilglucosaminidasas; que son enzimas capaces de hidrolizar en los extremos no reductores de los residuos de N-acetil-Dglucosamina (GlcNAc) de los oligosacáridos de quitina, liberando monómeros de GlcNAc. Se ha visto que las Hex además de hidrolizar son capaces de llevar a cabo transglicosilación (TGA), transfiriendo un oligosacárido a un aceptor adecuado para formar un nuevo enlace glucosídico; obteniendo así oligosacáridos con grado específico de polimerización y acetilación. Por lo anterior, el objetivo del presente trabajo fue purificar las Hex e hidrofobinas de Lecanicillium lecanii en cultivo sumergido. En la primera etapa experimental, se purificó la Hex obteniendo una enzima pura de 50 kDa. Se evaluó su actividad TGA sobre sustratos donadores, produciendo oligosacáridos transglicosilados con un grado de polimerización entre 2 y 6 con varios grados de acetilación. En la segunda etapa experimental se identificaron y secuenciaron los péptidos de Hex, los cuales, presentaron identidad con una quitinasa de Rhizopus oligosporus. Adicionalmente, se evaluaron sustratos diferentes a los empleados en la primera etapa, para llevar acabo TGA, donde Hex fue capaz de transglicosilar sin requerir un sustrato aceptor, produciendo oligosacáridos con grado de polimerización de 3 a 6. En la tercera etapa experimental, mediante espectroscopía de dicroísmo circular se observó que Hex no sufre cambios en su estructura secundaria al llevar acabo la reacción de hidrolisis y/o la TGA, o incluso evaluando diferentes temperaturas y valores de pH, lo que se atribuyó a cambios locales en los aminoácidos del sitio activo. Finalmente, en la cuarta etapa, se logró purificar una hidrofobina de clase I de 12 kDa a partir de la biomasa obtenida del cultivo sumergido, esta proteína permitió modificar superficies hidrofóbicas e hidrofílicas.
Lecanicillium lecanii is an entomopathogenic fungus used commercially as a biocontrol alternative in agriculture and horticulture. Inside the infection process enzymes and proteins such as chitinases, proteases, lipases and hydrophobins are produced. In the classification of chitinases are β-N-acetylglucosaminidases; which are enzymes capable of hydrolyzing at the non-reducing ends of N-acetylD-glucosamine (GlcNAc) residues of chitin oligosaccharides, releasing GlcNAc monomers. In addition to hydrolyzing Hex has been found to be capable of carrying out transglycosylation (TGA), transferring an oligosaccharide to a suitable acceptor to form a new glycosidic bond; Thus, obtaining oligosaccharides with a specific degree of polymerization and acetylation. Therefore, the objective of the present work was to purify the Hex and hydrophobins of Lecanicillium lecanii in submerged culture. In the first experimental stage, the Hex was purified obtaining a pure enzyme of 50 kDa. Its TGA activity on donor substrates was evaluated, producing transglycosylated oligosaccharides with a degree of polymerization between 2 and 6 with various degrees of acetylation. In the second experimental stage, the Hex peptides were identified and sequenced, which presented identity with a Rhizopus oligosporus chitinase. Additionally, different substrates were evaluated from those used in the first stage, to carry out TGA, where Hex was able to transglycosylate without requiring an acceptor substrate, producing oligosaccharides with a degree of polymerization of 3 to 6. In the third experimental stage, by circular dichroism spectroscopy, it was observed that there are no changes in the secondary structure of Hex, when carrying out the hydrolysis reaction or TGA evaluating different temperatures and pH values, which was attributed to local changes. in the amino acids of the active site. Finally, in the fourth stage, it was possible to purify a hydrophobin class I of 12 kDa from the biomass obtained from the submerged culture, this protein allowed modifying hydrophobic and hydrophilic surfaces.
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