Estandarización del proceso de extracción e identificación de Flavonoides en Nopal (Opuntia ficus-indica Mill.) cultivar Atlixco desespinado Público Deposited
Los flavonoides son compuestos de bajo peso molecular ubicuos en las plantas, en las que se encuentran generalmente unidos a otros tipos de compuestos, lo cual dificulta la identificación de los mismos. El interés sobre este tipo de polifenoles radica en sus propiedades funcionales, tal como la prevención de enfermedades crónico-degenerativas, pues actúan como antioxidantes, antinflamatorios, antibióticos, etc. Particularmente en nopal, los flavonoides identificados mayoritariamente corresponden a glucósidos de isoramnetina, los cuales han sido asociados por su actividad antiproliferativa sobre células en cáncer de colon. La importancia de los flavonoides ha generado el desarrollo de diferentes técnicas analíticas que permitan caracterizarlos, sin embargo, en la actualidad no existe una metodología estandarizada para la obtención de éstos, debido a que dicho proceso se ve afectado por diversos factores, entre los que se incluyen el tipo de matriz, los flavonoides específicos a estudiar y las condiciones técnicas del análisis. Con base en lo anterior, el objetivo del presente estudio fue estandarizar el proceso de obtención e identificación de flavonoides contenidos en cladodios de nopal Opuntia ficusindica Mill. cultivar Atlixco, considerando la importancia socioeconómica y nutrimental de este producto en el país, permitiendo con ello incrementar el conocimiento sobre las propiedades funcionales que ofrece. La investigación contempló en su etapa preliminar el análisis del contenido de fenoles y flavonoides totales. Posteriormente se evaluaron las etapas para la obtención de los flavonoides específicos de interés en nopal, contemplando la comparación de formas para el manejo de la muestra (fresca y liofilizada), métodos de extracción (metanólica y con hidrólisis ácida), proceso de purificación, así como 5 tiempos de calentamiento (sin calentamiento, 0.5, 1.0, 2.0 y 4.0 horas) del método de extracción seleccionado, monitoreando cada una de las etapas mediante barridos espectrales, cromatografía en capa fina y espectrometría de masas. El contenido de fenoles y flavonoides totales en los cladodios de nopal cultivar Atlixco fue de 1.41 ± 0.19 mg equivalentes de ácido gálico (EAG)/ g nopal fresco y de 193.7 ± 9.7 µg equivalentes de quercetina (EQ) / g nopal fresco, respectivamente. Las condiciones metodológicas establecidas para la obtención de los flavonoides de interés en nopal cultivar Atlixco fueron las siguientes: la muestra debe liofilizarse; la extracción debe hacerse con hidrólisis ácida (0.5 g nopal liofilizado + 20 mL metanol 62.5%+ 5 mL HCl 6M; reflujo a 65°C por 2 h); es indispensable realizar un proceso de purificación utilizando un eluyente constituido por una mezcla de agua: metanol: acetonitrilo (25:25:50). La evaluación del periodo de calentamiento durante la hidrólisis ácida permitió una extracción diferenciada de flavonoides. Con la metodología anterior se logró pre-identificar la posible presencia de los flavonoides quercetina después de 0.5 h; kaempferol e isoramnetina, así como los ácidos fenólicos simples ferúlico y cafeico despúes de 2 h y vitexina a las 4 horas de calentamiento. La confirmación de la existencia de estos compuestos en el nopal estudiado está sujeta a análisis complementarios por HPLC- masas
Flavonoids are low molecular weight compounds that occur in plants, which are generally linked to other types of compounds, making difficult to identify them. Interest in this type of polyphenols lies on its functional properties such as the prevention of chronic-degenerative diseases since they act as antioxidants, anti-inflammatories, antibiotics, etc. Particularly in nopal, the identified flavonoids mostly correspond to isoramnetin glucosides, which have been associated because of their antiproliferative activity on colon cancer cells. The importance of flavonoids has led to the development of different methods for studying them, however, there is no an unique methodology to obtain them, due to the fact that several factors are involved including the type of matrix, the specific flavonoids to be studied, and technical conditions of analysis. Based on the above, the present study aimed to standardize a methodology to extract and identify the flavonoids content in cladodes of nopal Opuntia ficus-indica Mill. cultivar Atlixco because of the socioeconomic and nutritional importance of this product in Mexico, allowing to increase the knowledge about the functional properties offered by this commodity. This study consisted in an initial analysis of the content of phenols and total flavonoids. The following stages were then evaluated for obtaining the specific flavonoids of interest in nopal, such as ways for sample handling (fresh and freeze-dried), extraction methods (methanolic and through an acid hydrolysis), purfiying-process, as well as heating times of the selected extraction method (no heating, 0.5, 1.0, 2.0 and 4.0 hours). Each stage was verified through spectral sweeps, thin layer chromatography and mass spectrometry. The content of phenols and total flavonoids in the nopal cladodes (Opuntia ficus-indica Mill.) Atlixco cultivar was 1.41 ± 0.19 mg of gallic acid (EAG) / g fresh nopal and 193.7 ± 9.7 μg of quercetin (EQ) )/ g fresh nopal, respectively The methodological conditions established for obtaining the flavonoids of interest in nopal cultivar Atlixco were as follows: the sample should be freeze-dried; the extraction must be done through an acid hydrolysis (0.5 g lyophilized nopal + 20 mL methanol 62.5% + 5 mL 6M HCl, reflux at 65 ° C for 2 h). It is essential to carry out a purifying process using an eluent constituted by a mixture of water: methanol: acetonitrile (25:25:50), which in this case was the IV most selective. The evaluation of the heating time during the acid hydrolysis allowed a differentiated extraction of flavonoids. With this methodology, the flavonoids kaempferol, isoramnetin, quercetin and vitexin as well as the ferulic and caffeic simple phenolic acids were pre-identified. Corroboration of these compounds must be confirmed by complementary analysis by liquid chromatograph/ mass spectrometry
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