Identificación y caracterización parcial de proteínas con actividad antimicrobiana producidas por Lactobacillus Paraplantarum aislada de un producto cárnico Pubblico Deposited
Lactic acid bacteria (BAL) can produce antimicrobial protein compounds like bacteriocins, peptidoglycan hydrolases (PGHs) and recently, some ribosomal proteins have been identified. Among the BAL genera that produce antimicrobial protein compounds are Lactococcus, Leuconostoc, Pediococcus, Enterococcus and Lactobacillus. In the working group led by PhD Edith Ponce Alquicira (UAM-Iztapalapa) a strain of a meat product (salami) with antimicrobial activity was isolated. Therefore, the aim of this work was to determine if the antimicrobial activity present in the cell-free extract (supernatant) is due to antibacterial protein compounds, as well as to evaluate the effect of carbon and nitrogen concentration in the culture medium on antimicrobial activity. The amplification of the 16S rRNA gene reference gene and the recA gene; in addition to the protein profile obtained by mass spectrometry (MALDI-TOF-Biotyper), they were used to identify the strain. Once the strain was identified as Lactobacillus paraplantarum, the antimicrobial activity of the cell-free extract (supernatant) produced by the strain was determined, as well as the bacteriocin and PGH extracts by agar diffusion test. Proteins with antimicrobial activity were identified using zymograms against Micrococcus lysodeiktikus and polyacrylamide gels (SDSPAGE), where bands corresponding to antimicrobial activity were sent to be identified by mass spectrometry. Subsequently, the effect of different carbon and nitrogen concentrations in the culture medium on growth kinetics, pH and antimicrobial activity. In addition, the antogonic activity of L. paraplantarum was determined against microorganisms of interest in food. Finally, the nature of the antimicrobial activity of PGH extract was identified by the method of substrate specificity. In the identification of the complete 16S rRNA gene, the percentage of similarity of the strain with respect to a BLAST-n sequence was 92% for L. plantarum and L. paraplantarum, so amplification of the recA gene was performed for differentiation of these two species; being positive for L. paraplantarum with an amplicon of 107 bp. The identification by genus and species was corroborated by mass spectrometry with a 2.16 score generated by MALDI-TOF Biotyper. With regard to antimicrobial activity, extracts obtained from L. paraplantarum showed antimicrobial activity against Listeria innocua, with an activity 2.3 times higher in PGH extract with regard to the extract of the bacteriocin (ribosomal protein). On the other hand, L. paraplantarum presented bands of antimicrobial activity in 13.1- and 66.6- kDa in polyacrylamide gels, Tris-Tricine and Tris-Glycine, respectively, obtaining as a result of mass spectrometry identification for the low protein molecular weight to the 50S ribosomal protein L14 and for the high molecular weight protein, a muraramidase, which was verified by substrate specificity by testing positive for Nacetylmuramidase. These results provide relevance, due to the first vision of antimicrobial activity by a ribosomal protein and a PGH produced by L. paraplantarum; demonstrating the strain´s ability to produce new ampromicrobial compounds. Therefore, its research is suggested for use in the food industry as bioconservatives and in the pharmaceutical industry as a replacement for antibiotics. Regarding the effect of different carbon and nitrogen concentrations on the culture medium, greater growth and antimicrobial activity in L. paraplantarum was obtained by increasing 2.1 times the concentration of nitrogen in the culture medium. Finally, L. paraplantarum presented antagonistic activity against microorganisms of interest in foods such as L. innocua, Weissella viridescens, Salmonella spp. and Escherichia coli.
Las bacterias ácido lácticas (BAL) pueden producir compuestos de naturaleza proteica con actividad antimicrobiana como bacteriocinas, peptidoglucano hidrolasas (PGHs) y recientemente identificadas, algunas proteínas ribosomales. Dentro de los géneros de BAL productoras de compuestos antimicrobianos de naturaleza proteica se han reportado Lactococcus, Leuconostoc, Pediococcus, Enterococcus y Lactobacillus. En el grupo de trabajo dirigido por la Dra. Edith Ponce Alquicira (UAM-Iztapalapa) se aisló una cepa de un producto cárnico (salami) con actividad antimicrobiana; por lo que el objetivo de este trabajo fue determinar si la actividad antimicrobiana presente en el extracto celular se debe a compuestos antimicrobianos de naturaleza proteica, así como evaluar el efecto de la concentración de carbono y nitrógeno en el medo de cultivo en la actividad antimicrobiana. La cepa de estudio fue identificada como Lactobacillus paraplantarum mediante amplificación del gen de referencia 16S ARNr y del gen recA; además del perfil proteico obtenido por espectrometría de masas (MALDI-TOF-Biotyper). Se determinó la actividad antimicrobiana del extracto crudo producido por esta cepa, así como de los extractos de bacteriocinas y PGHs mediante la prueba de difusión en agar. Se observó la actividad antimicrobiana de las proteínas mediante el empleo de zimogramas contra Micrococcus lysodeikticus; las bandas correspondientes a la actividad antimicrobiana fueron identificadas por espectrometría de masas. Posteriormente, se evalúo el efecto de diferentes concentraciones carbono y nitrógeno en el medio de cultivo sobre la cinética de crecimiento, pH y la actividad antimicrobiana. Además, se determinó la actividad antagónica de L. paraplantarum frente a microorganismos de interés en los alimentos. Finalmente se identificó la naturaleza de la actividad antimicrobiana del extracto de PGH mediante el método de especificidad de sustrato. En la identificación del gen 16S ARNr completo, el porcentaje de similitud de la cepa con respecto a una secuencia del BLAST-n fue del 92% para L. plantarum y L. paraplantarum, por lo que se realizó la amplificación del gen recA para la diferenciación de estas dos especies; siendo positivo para L. paraplantarum con un amplicón de 107 pb. La identificación por género y especie se corroboró por espectrometría de masas con un nivel de fiabilidad de 2.16 generado mediante MALDI-TOF Biotyper. Con respecto a la actividad antimicrobiana, los extractos obtenidos de L. paraplantarum mostraron actividad antibacteriana contra Listeria innocua, con una actividad 2.3 veces mayor en el extracto de PGH con respecto al extracto de la bacteriocina (proteína ribosomal). Por otra parte, L. paraplantarum presentó bandas de actividad antibacteriana en 13.1- y 66.6- kDa en geles de poliacrilamida, Tris-Tricina y Tris-Glicina, respectivamente. Los resultados de la identificación por espectrometría de masas fueron para la proteína de bajo peso molecular, la 50S proteína ribosomal L14 y para la proteína de alto peso molecular, una muraramidasa, el cual se verificó mediante especificidad por sustrato al dar positivo para N-acetilmuramidasa. Los resultados obtenidos proporcionan relevancia, debido a la primera visión de actividad antimicrobiana por una proteína ribosomal y una PGH producida por L. paraplantarum, demostrando la capacidad de la cepa en producir nuevos compuestos antimicrobianos. Por lo que se sugiere su investigación para uso en la industria alimentaria como bioconservadores y en la industria farmacéutica como reemplazo a los antibióticos. En cuanto al efecto de las diferentes concentraciones carbono y nitrógeno en el medio de cultivo, se obtuvo un mayor crecimiento y actividad antimicrobiana en L. paraplantarum al incrementar 2.1 veces la concentración de nitrógeno en el medio de cultivo. Por último L. paraplantarum presentó actividad antagónica contra microrganismos de interés en alimentos como L. innocua, Weissella viridescens, Salmonella spp. y Escherichia coli.
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