Producción de extractos enzimáticos a partir de Fomes sp. EUM1 y su evaluación en condiciones ruminales Pubblico Deposited
This study evaluated the ability of Fomes sp. EUM1, a previously identified thermotolerant fungal strain, to grow in superficial culture media, in Petri dishes, using 13 different agricultural by-products. The strain produced lignocellulolytic enzymes in a range of pH from 4.5 to 7.4. From the substrates tested, corn stover promoted the highest production of cellulases and laccases with an activity of 18.3 and 0.9 IU mL ̄¹, respectively. The maximal xylanase production was in barley straw (26 IU ml⁻¹ ), however, the laccase production was the lowest (0.4 IU ml⁻¹ ), in addition to the lowest growth with diameter 5.5 cm after 7 days (P˂0.05). These results suggested that lignocelullolytic enzymes can be produced by the thermotolerant fungus Fomes sp. EUM1 in solid substrates using corn stover substrate only (Rm) and supplemented with 20% wheat bran (Rm:St). The supplementation increased (P˂0.05) the xylanase production (160 IU g ms-1 ) after 5 days of culture. Cellulases showed no difference in the production on the fifth day of culture, for Rm and Rm: St, 33 and 37 IU g ms-1 , respectively; however the addition of wheat bran caused a decrease in activity on day 6. Laccase activity reached a production of 3 IU g ms-1 with the Rm: St, maintaining this level of production until day 7 of culture. Moreover, the stability tests at 39 °C and pH 6, measured as half-life (t ½) of the crude enzyme extracts for these three enzymes showed that those t ½for cellulases and xylanases did not showed significant differences (P˂0.05) for both substrates, while for laccases different patterns were observed for t ½, in fact this value was doubled in extracts from Rm Ext: St (26.6 h). Both extracts from Fomes sp. EUM1 and a commercial enzyme product (Fibrozyme®) were used in different forages as corn stover, bagasse and alfalfa hay to measure ruminal digestibility and gas production in vitro. The fractional rate of gas production (FR; mL g-1 h -1 ) increased (P˂0.05) at 9 h in corn stover compared with treatment without enzymes. The use of enzymes always favored a higher maximum gas volume (Vm, h-1 ) in the bagasse. The in vitro digestibility (IVD) of corn stover increased (12%) compared to the control, using the commercial product; whereas the enzymatic extracts obtained by Fomes sp. EUM1 in corn stover and corn stoverwheat bran showed an increase in the digestibility of 16 and 21% (P˂0.05), respectively, suggesting a higher specificity of these enzymes produced on the same substrate (Rm). Besides proven stability, versatility extracts Rm and Rm:St was confirmed by the increase in the in vitro digestibility values for bagasse (100%) compared to the untreated enzymes. From the results obtained in these in vitro tests, effects of the crude enzyme extract (Ext Rm:St) produced by solid state fermentation were evaluated using animals in vivo, measuring both digestibility and productive performance of lambs fed a forage: concentrate 60:40. The fungus was grown (6 d) and enzyme activity was measured being 169 IU g ms-1 , 50 IU g ms-1 and 4 IU g ms-1 for xylanases, cellulases and laccases, respectively. For these experiments during for 58 days,18 Criollos x Suffolk lambs were used, weighing initial (PI) of 20 ± 0.5 kg. Treatments consisted of three doses of Rm Ext: St per kg of dry corn stover: 0, 60 and 120 mL, which were sprayed to the fodder 24 h before being provided. The lambs were weighed every 14 days. On day 58 samples were taken to determine rumen fluid volatile fatty acids (VFA) and enzymatic activity. No differences (P>0.05) among treatments for enzymatic dose effect on consumption of DM, OM, NDF and ADF. Moreover, lambs the average daily gain showed a linear effect (P˂0.08) positive use Ext Rm: St. The digestibility of DM, NDF and ADF increased with the average dose of enzyme extract (quadratic effect, P˂0.05). The cellulase activity in the rumen fluid showed a linear increase (P˂0.05) depending on the dose of extract. With the above results show that the enzymatic extracts obtained from Fomes sp. EUM1 are an alternative for use on lignocellulosic residues, focusing the pretreatment of fodder for inclusion to the diet. The contribution of fibrolytic enzymes alternatively kept for use in animal feed because it may increase the binding sites to the fibers by ruminal bacteria.
En este estudio se evaluó la capacidad del hongo termotolerante Fomes sp. EUM1 para crecer en cultivo superficial utilizando 13 diferentes subproductos agrícolas. Se encontró que es capaz de crecer y producir enzimas lignocelulolíticas en un intervalo de pH de 4.5 a 7.4. A los 7 días de cultivo en cajas Petri se obtuvo el extracto crudo enzimático y se determinó la producción enzimática. De los subproductos evaluados, el rastrojo de maíz promovió la mayor producción de celulasas y lacasas siendo de 18.3 y 0.9 UI mL¯¹ , respectivamente. La mayor producción de xilanasas fue en la paja de cebada (26 UI mL¯¹ ), sin embargo, la producción de lacasas fue la más baja (0.4 UI mL¯¹ ) además presentó el menor diámetro de crecimiento (P˂0.05). A partir de lo anterior, se determinó la producción de enzimas lignocelulolíticas por el hongo termotolerante Fomes sp. EUM1 en cultivos sólidos usando como sustrato únicamente rastrojo de maíz (Rm), así como suplementado con 20% de salvado de trigo (Rm:St). Esta suplementación aumentó (P˂0,05) la producción de xilanasas (160 UI g ms¯¹), a los 5 días de cultivo. Las celulasas no mostraron diferencias en la producción al quinto día de cultivo, para Rm y Rm:St, 33 y 37 UI g ms¯¹, respectivamente: sin embargo, el agregar salvado de trigo originó una disminución menor en la actividad, al día 6. La actividad de lacasas alcanzó una producción de 3 UI gms¯¹ al utilizar el Rm:St, manteniendo este nivel de producción hasta al día 7 de cultivo. Por otra parte; los ensayos de estabilidad (39 ⁰C y pH 6), medida como tiempo de vida media (t ½), de los extractos crudos enzimáticos para estas tres enzimas evaluadas, mostraron que el t ½ para las celulasas y xilanasas no mostraron diferencias significativas (P˃0.05) para ambos sustratos; mientras que para las lacasas se observaron diferentes patrones de t ½, alcanzando a duplicarse para el Ext Rm:St (26.6 h). Ambos extractos de Fomes sp. EUM1 y un producto enzimático comercial (Fibrozyme®)se utilizaron en diferentes forrajes como el rastrojo de maíz, bagazo de caña y heno de alfalfa, para medir la digestibilidad y producción de gas in vitro. La tasa fraccional de producción de gas (FR; mL g-1 h -1 ) aumentó (P˂0.05) a las 9 h en rastrojo de maíz comparada con el tratamiento sin enzimas. El uso de enzimas siempre favoreció un mayor volumen de gas máximo (Vm, h¯¹) en el bagazo de caña. La digestibilidad in vitro (DIV) del rastrojo de maíz aumento (12%) con respecto al control, al usar el producto comercial, mientras que los extractos enzimáticos originados por Fomes sp. EUM1, en rastrojo de maíz y rastrojo de maíz con salvado de trigo mostraron un incremento en la digestibilidad del 16 y 21 % (P˂0.05), respectivamente, lo que sugiere una mayor especificidad de estas enzimas producidas en el mismo sustrato (Rm). Además de la estabilidad probada, la versatilidad de los extractos de Rm y Rm:St fue confirmada por el aumento en los valores de digestibilidad in vitro para bagazo de caña (hasta 100%) en relación con el testigo sin enzimas. De los resultados obtenidos en las pruebas in vitro, se evaluó el efecto del extracto crudo enzimático (Ext Rm:St) producido mediante fermentación en estado sólido por el hongo Fomes sp. EUM1, en la digestibilidad y comportamiento productivo de corderos, alimentados con una dieta forraje:concentrado de 60:40. El hongo se cultivó (6 d) y se midió la actividad enzimática alcanzada, siendo de 169 UI g ms -1 , 50 UI g ms -1 y 4 UI g ms-1 , para xilanasas, celulasas y lacasas, respectivamente. Para la prueba in vivo se utilizaron 18 corderos Suffolk x criollos con un peso inicial (PI) de 20 kg ± 0.5 por 58 días. Los tratamientos consistieron en tres dosis del Ext Rm:St por kg de materia seca de rastrojo de maíz 0, 60 y 120 mL, asperjado al forraje 24 h antes de ser proporcionado. Los corderos se pesaron cada 14 días. En el día 58 se tomaron muestras de líquido ruminal para determinar ácidos grasos volátiles (AGV) y la actividad enzimática. No se encontraron diferencias (P>0.05) entre tratamientos por efecto de la dosis enzimática en el consumo de MS, MO, FDN y FDA. Por otra parte, la ganancia diaria de peso presentó un efecto lineal (P˂0.08) positivo al uso del Ext Rm:St. La digestibilidad de la MS, FDN y FDA presentaron incrementó con la dosis media de extracto enzimático (efecto cuadrático, P˂0.05). La proporción de ácido butírico también se incrementó con la dosis de 120 mL kg-1 MS (efecto cuadrático, P˂0.05). La actividad de celulasas en el líquido ruminal presentó un incremento lineal (P˂0.05) en función de la dosis de extracto. El Ext Rm:St del basidiomiceto termotolerante Fomes sp. EUM1 favorecieron la actividad celulolítica en el líquido ruminal, manifestándose una mayor ganancia de peso en los corderos a mayor dosis de enzima. Con los resultados anteriores se muestra que los extractos enzimáticos obtenidos de Fomes sp. EUM1 son una alternativa para su uso sobre residuos lignocelulósicos, enfocándose al tratamiento previo de los forrajes para su inclusión a la dieta. El aporte de enzimas fibrolíticas lo mantienen como alternativa para su uso en la alimentación animal, debido a que posiblemente aumente los sitios de unión a las fibras por parte de las bacterias ruminales.
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