Evidencias de maduración espermática durante el almacenamiento prolongado en hembras del murciélago Corynorhinus Mexicanus Public Deposited
La maduración espermática es un proceso que le permite a los espermatozoides de mamíferos alcanzar el potencial fertilizante, el cual ocurre desde las gónadas masculinas hasta el tracto genital de las hembras. En algunas especies de quirópteros como Corynorhinus mexicanus, presentan un largo periodo de almacenamiento, el cual se ha considerado desde hace algunas décadas puede influir en el proceso de maduración de los espermatozoides en esta especie. El almacenamiento espermático es una estrategia ampliamente utilizada por el grupo de los quirópteros., Los sitios de almacenamiento que se han reportado son la cauda epididimaria en machosy la región útero-tubaria en la hembra. Debido a que el gameto masculino se debe mantener viable hasta el momento de la copula, su fisiología se ve modificada durante su trayecto hasta el encuentro con su contraparte femenina, el ovocito. En C. mexicanus,se presentan dos periodos de almacenamiento bien establecidos, el primero en la cauda epididimaria donde los espermatozoides pasan hasta 6 meses y un segundo periodo en la unión útero tubaria en la hembra. Se ha reportado que los espermatozoides de C. mexicanus tienen un proceso de maduración epididimaria lenta, ya que existe un aumento gradual del porcentaje de gametos maduros en relación con el tiempo que pasan almacenados.Algunos indicadores usados para medir este parámetro fueron: el porcentaje de espermatozoides capacitados, como indicador indirecto de maduración, en conjunto con indicadores fisiológicos que participan durante este proceso de maduración en el tracto reproductor femenino como: la fosforilación de tirosinas y su respuesta al pH intracelular.
Sin embargo, no existe un estudio en el que se demuestre si el tiempo de almacenamiento influye sobre la fisiología espermática, específicamente durante el tránsito del espermatozoide de la región utero-tubaria hasta su encuentro con el ovocito. Es por lo anterior que, el objetivo de este trabajo fue determinar si los indicadores de maduración como el porcentaje de espermatozoides capacitados, la externalización de fosfatidilserina (PS), las concentraciones intracelulares de calcio, la fosforilación de tirosinas y su respuesta al pH intracelular, incrementan en el periodo de almacenamiento en el tracto reproductivo de la hembra, como indicativo del estado de maduración de las células. Se colectaron y se extrajeron los espermatozoides de 9 hembras adultas durante los meses de almacenamiento (noviembre y diciembre). Las células fueron sometidas a capacitación in vitro (37°C, 5% CO2) para posteriormente teñirlos con Clorotetraciclina (CTC) y contabilizar los patrones de tinción en dos diferentes pH. Posteriormente, se determinó la externalización de fosfatidilserina (PS) empleando Anexina-V. Se utilizó FLUO 3 AM para determinar la concentración de calcio intracelular. Finalmente, para determinar la cantidad de proteínas que presentan fosforilación de tirosinas se empleó pY-20. Se observó un aumento del 3% de espermatozoides capacitados de noviembre a diciembre,que además se encuentra asociado a un aumento en el pH en el medio de capacitación y a un incremento en la marca de FLUO 3 AM de noviembre a diciembre y en el porcentaje de los espermatozoides marcados por Anexina-V y la marca en sí, en la membrana de los espermatozoides. Parámetros que,en conjunto, podrían estar favoreciendo la fosforilación de tirosinas,que se eleva 1.7 de noviembre a diciembre. En conjunto, estos indicadores sugieren la existencia de un evento que posterga la maduración de las células previo a la capacitación espermática durante el periodo de almacenamiento en el tracto reproductor femenino.
Sperm maturation is a process that allows mammalian sperm to reach fertilizing potential, which occurs from the male gonads to the female genital tract. In some species of Chiroptera such as Corynorhinus mexicanus, they have a long storage period, which has been considered for some decades to influence the sperm maturation process in this species. Sperm storage is a strategy widely used by the group of Chiroptera, the storage sites that have been reported are the cauda epididymisin males and the utero-tubal region in the female.Due that male gamete must remain viable until copulation, its physiology is modified during its journey to the encounter with its female counterpart, the oocyte. In C. mexicanus, there are two well-established storage periods, the first in the cauda epididymis where the sperm remains up to 6 months and a second period in the utero-tubal junction in the female. It has been reported that C. mexicanus spermatozoa undergo slow epididymal maturation process, since there is a gradual increase in the percentage of mature gametes in relation to the time they were stored. Some indicators used to measure this parameter were: the percentage of capacitated spermatozoa, as an indirect maturation indicator, together with physiological indicators that participate during this maturation process in the female reproductive tract such as: tyrosine phosphorylation and its response to intracellular pH. However, there is no study showing whether the storage time influences sperm physiology, specifically during the transit of sperm from the utero-tubal junctionto meet the oocyte.
Therefore, the aim of this work was to determine if maturation indicators such as percentage of capacitated spermatozoa, externalization of phosphatidylserine (PS), intracellular calcium concentrations, tyrosine phosphorylation and its response to intracellular pH,increase in the storage period inthe female reproductive tract, as an indication of the state of maturation of cells. Sperm were collected and extracted from 9 adult females during the months of storage (November and December). The cells were subjected to in vitro capacitation (37°C, 5%CO2) and then stained with Chlorotetracycline (CTC) and counted the staining pattern sat two different pHs. Subsequently, the externalization of phosphatidylserine (PS) was determined using Anexin-V. FLUO 3 AM was used to determine intracellular calcium concentration. Finally, pY-20 was used to determine the amount of proteins with tyrosine phosphorylation. An increase of 4% of capacitated spermatozoa was observed from November to December, which is also associated with an increase in the pH of the capacitation medium and an increase in [Ca2+]i from November (IF: 952.45) to December (IF: 18939.2656). These parameters, together, could be favoring the phosphorylation of tyrosines, which rises from November (IF: 11205.04) to December (IF:18449.16). Together, these indicators suggest the existence of an event that delays the maturation of cells prior to sperm capacitation during the storage period in the female reproductive tract.
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