Erythropoietin (EPO) is a 34 kDa glycoprotein hormone that induces hematopoiesis and has pharmaceutical applications in the treatment of secondary anemias. Since its expression in Chinese hamster ovary (CHO) cells in 1985, mammalian cell systems have remained the standard for EPO production due to structural requirements despite their high costs, large nutritional requirements, contamination risks, and sensitivity to yield stress. This project aimed to establish Neurospora crassa (N. crassa), a filamentous fungus, as an alternative system for the heterologous expression of glycoproteins, using human erythropoietin as a model. N. crassa was selected due to its low nutritional requirements, its high secretion rates, its capacity to perform N-glycosylation, and its capacity to photo- regulate its genes. Altogether, these qualities suggest N. crassa as an accessible and efficient expression system for recombinant glycoprotein production. To achieve this, we designed a fusion protein by adding a secretion signal sequence from the fungus’s glucoamylase-1 to the N-terminus and a histidine tag to the C-terminus. The gene encoding this fusion protein, named SigGla – rhEPO – HisTag, was cloned into the pMF272 vector under the control of the light-inducible promoter Pccg-1. The final expression vector was used to transform the auxotroph to histidine strain N. crassa #9717. We used the strain N. crassa EPO 6+, one of the six successfully transformed strains, to produce recombinant human EPO (rhEPO) through solid-state fermentation (SSF). The secretome produced in SSF by the wild and mutated strains was analyzed by SDS-PAGE to identify the presence or absence of rhEPO. The analyzed samples corresponded to the extracellular proteins present in the media at 24, 48, 72, and 96 hours of fermentation. It was observed that the N. crassa EPO 6+ strain showed bands at 37 kDa (close to the corresponding 34 kDa of human EPO) starting at 24 hours. In contrast, the native strain lacked them, thus suggesting the successful expression of rhEPO by the engineered fungus. Nonetheless, further purification, characterization, and quantification of the protein are required to confirm that the observed protein is rhEPO, determine its glycosylation patterns, and define production yields.
La eritropoyetina (EPO) es una hormona de carácter glicoproteico, cuya función biológica es inducir la hematopoyesis. Estructuralmente está compuesta por una cadena de 165 residuos de aminoácidos, con dos puentes disulfuro, tres N-glicosilaciones y una O- glicosilación, con un peso molecular de 34 kDa. La EPO, es una molécula de alto interés farmacológico para el tratamiento de anemias secundarias debidas al fallo renal crónico, a quimioterapia u otras causas. La EPO ha sido utilizada terapéuticamente desde su exitosa clonación y expresión en células ováricas de hámster chino (CHO, por sus iniciales en inglés) desde 1985. Desde esta fecha, el sistema de expresión preferido (las células CHO) se ha conservado inalterado a pesar de que se han probado otros sistemas de expresión, como las células renales de cría de hámsteres (BHK) y las células humanas de fibrosarcoma (HT1080). Todos estos sistemas de expresión, basados en células de mamífero, se siguen utilizando debido a la naturaleza estructural de la EPO; sin embargo, estos sistemas implican altos costos de producción y un riesgo de contaminación considerablemente mayor que con otros cultivos celulares. Por lo tanto, este proyecto propone al hongo filamentoso Neurospora crassa como una alternativa para la expresión heteróloga de proteínas glicosiladas, utilizando como modelo a la eritropoyetina humana. Se seleccionó N. crassa debido a sus bajos requerimientos nutricionales, su capacidad de sintetizar modificaciones postraduccionales, su capacidad de secreción de proteínas y su capacidad de fotoregulación de genes, que, en conjunto ofrecen el potencial para establecer un sistema de producción de glicoporteínas eficaz y accesible. Para producir rhEPO, se diseñó una proteína de fusión adicionando una secuencia de secreción proveniente de la glucoamilasa-1, propia del hongo, en el extremo N-terminal, y una cola de histidinas en el extremo C-terminal. Al gen codificante de esta proteína de fusión se le llamó SigGla – rhEPO – HisTag y fue clonado en el vector pMF272 bajo el control del promotor inducible por luz azul Pccg-1. Esta construcción se utilizó para transformar la cepa auxótrofa a histidina de N. crassa #9717. Se utilizó una de las seis cepas obtenidas tras la trasformación del hongo, la cepa N. crassa EPO 6+, para la producción de eritropoyetina humana recombinante (rhEPO) por cultivo en medio sólido. Se realizó una cinética de producción tomando muestras cada 24 h, todas en las mismas condiciones, hasta las 96 h de cultivo. Los extractos extracelulares fueron analizados mediante SDS-PAGE para comparar los secretomas de la cepa transformante y la cepa nativa. Se observó que la cepa N. crassa EPO 6+ presenta bandas de 37 kDa (el peso aproximado a la EPO humana) a partir de las 24 h, mientras que la cepa nativa carece de ellas. Esta evidencia indica la secreción de rhEPO; sin embargo, se requiere de purificar la proteína y caracterizarla por espectrometría de masas para asegurar con certeza que se está expresando de forma correcta. Adicionalmente, la espectrometría de masas permitirá conocer los patrones de glicosilación realizados por N. crassa, definiendo las siguientes estrategias a seguir para mejorar al sistema de producción propuesto.
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