Determinación del criterio de escalamiento en un cultivo sumergido para la producción de quitinasas de Lecanicillium lecanii Pubblico Deposited
El propósito del presente proyecto fue determinar el criterio de escalamiento de la producción de quitinasas de Lecanicillium lecanii en un cultivo sumergido, utilizando un biorreactor de 3 L. Para tal fin, se determinó el coeficiente volumétrico de transferencia de masa (KLa) y el número de Reynolds (Re). Estos criterios fueron seleccionados debido a que se trabajó con un cultivo aerobio, por lo que se necesitaba conocer como afecta la transferencia de oxígeno al proceso y por otra parte se deseaba conocer el tipo de fluido que comporta el cultivo y si cambia o no su viscosidad. En la primera etapa del proyecto se llevó a cabo el proceso de producción de enzimas quitinolíticas en cultivo sumergido, para lo cual se utilizaron las condiciones previamente reportadas por Rojas-Osnaya y col. (2015) las cuales fueron a una temperatura de 25°C, pH 6, volumen de trabajo de 1.6 L y utilizando una quitina coloidal con 4.8% de proteína residual como fuente de carbono y se analizó el efecto de la agitación y la aireación sobre la actividad quitinolítica de L. lecanii. El oxígeno disuelto, viscosidad y densidad fueron determinados para calcular el KLa y Re de cada tratamiento, además se determinó el CO2 como medida indirecta de la biomasa en el cultivo. Posteriormente la actividad específica Nhasa de los tratamientos se utilizó para la construcción de dos curvas de productividad para los criterios KLa y Re. En esta etapa, el tratamiento con el cual se obtuvo la mayor productivid Nhasa fue empleando 100 rpm de agitación y 1vvm de aireación, obteniéndose una actividad específica Nhasa de 0.54±0.0195 U mg-1 proteína y una productividad de 0.0045 ± 1.62x10-4 U mg-1 proteína h -1 con un valor de KLa de 5.58±0.25 h -1 y un Re de 38.1. La productividad enzimática mostró que el criterio de escalamiento con mayor relevancia fue el KLa, ya que se observa un intervalo de KLa en el que ésta se mantiene alta no obstante que se aumenta KLa. y Re. En esta etapa, el tratamiento con el cual se obtuvo la mayor productivid Nhasa fue empleando 100 rpm de agitación y 1vvm de aireación, obteniéndose una actividad específica Nhasa de 0.54±0.0195 U mg-1 proteína y una productividad de 0.0045 ± 1.62x10-4 U mg-1 proteína h -1 con un valor de KLa de 5.58±0.25 h -1 y un Re de 38.1. La productividad enzimática mostró que el criterio de escalamiento con mayor relevancia fue el KLa, ya que se observa un intervalo de KLa en el que ésta se mantiene alta no obstante que se aumenta KLa. En la región comprendida de KLa entre los 5-20 h -1 las productividades disminuyen. En cambio, en el Re, las productividades se mantienen constantes cuando Re aumenta. La hidrodinámica del reactor en el rango de variación de 100-400 rpm de agitación y 1-3vvm de aireación fue menos relevante sobre la productividad del proceso, no obstante que se mejoró la transferencia de oxígeno. En la última etapa del trabajo experimental se empleó una quitina coloidal con mayor porcentaje de proteína residual (12.3%) con las condiciones de aireación y agitación determinadas como las mejores. En este cultivo sumergido se obtuvo una mayor actividad específica Nhasa de 1.15± 0.03 U mg-1 proteína a las 144 h. El extracto crudo enzimático obtenido de este cultivo fue parcialmente purificado, recuperándose el 3.05% de la enzima con una actividad específica de 2.30 U mg-1 proteína y un factor de purificación de 1.14 mediante precipitación con sulfato de amonio (60%) y cromatografía de exclusión molecular.
The objective of this work was to determine the scaling criterion for the production of chitinases from the fungus Lecanicillium lecanii in submerged culture, in a 3 L bioreactor. For this purpose, the volumetric mass transfer coefficient (KLa) and the Reynolds number (Re) were determined. In the first stage of the experimental work, the production process of chitinolytic enzymes in submerged culture was carried out under the culture conditions previously reported by Rojas-Osnaya et al. (2015), using colloidal chitin with 4.8% remained protein varying agitation and aeration. The dissolved oxygen, viscosity and density were determined to calculate the KLa and Re for each treatment. The CO2 was determined as an indirect measurement of the fungal biomass. The specific Nhase activity of the treatments was calculated and expressed as productivity as function of KLa and Re criteria. In this stage, the treatment with the highest Nhase activity (0.54 ± 0.0195 U mg-1 protein) and productivity (0.0045 ± 1.62x10-4 U mg-1 protein h -1 ) was 100 rpm of agitation and 1vvm of aeration with a KLa of 5.58 ± 0.25 h-1 and a Re of 38.1. The enzymatic productivity showed that the most indicated scaling criterion was the KLa, since its variation showed a high productivity range. In the KLa region between 5-20 h-1 , the productivities decreased. On the other hand, in the Re, the productivities remained constant when Re increased. The hydrodynamics of the reactor in the range of variation of 100-400 rpm of agitation and 1-3 vvm of aeration was less relevant to the productivity of the process, although the oxygen transfer was improved. In the last stage of the experimental work, colloidal chitin with the high percentage of residual protein (12.3%) was used with the conditions of aeration and agitation previously selected. In this submerged culture batch the highest specific Nhase activity of 1.15 ± 0.03 U mg-1 protein was achieved at 144 h. The crude enzyme extract obtained from this batch was partially purified from proteases by salting out with ammonium sulfate (60%) and size exclusion chromatography, recovering 3.05% of the enzyme with specific activity of 2.30 U mg-1 Protein and purification factor of 1.14.
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