Establecimiento de cultivos celulares de Conyza filaginoides para la producción de metabolitos secundarios bioactivos Public Deposited
Conyza filaginoides es una planta originaria de México, conocida comúnmente como “simonillo”, y en la lengua náhuatl como "zacachichic”. En el México contemporáneo es ampliamente comercializada como un medicamento crudo para preparar infusiones y otras fitomedicinas (extractos, cápsulas o tabletas). Debido a ello, en los últimos años se han realizado numerosos estudios fitoquímicos de la planta silvestre los cuales han permitido identificar compuestos bioactivos con diversas propiedades farmacológicas validando su uso como planta medicinal, sin embargo, el creciente interés por esta especie ha derivado en su sobreexplotación limitando significativamente su propagación y distribución a nivel geográfico, ocasionando a que actualmente C.filaginoides sea una especie en riesgo de peligro de extinción, por tal motivo es importante la búsqueda de nuevas alternativas que permitan satisfacer la demanda comercial de la misma, con el objetivo de cuidar al mismo tiempo su preservación. La técnica de cultivo in vitro es una alternativa viable para obtener una amplia disponibilidad de la planta, ya que permite bajo condiciones controladas obtener compuestos bioactivos (metabolitos secundarios) de interés como ocurre en la planta silvestre e incluso cabe la posibilidad de incrementar los rendimientos de tales compuestos. El presente trabajo tuvo como objetivo establecer cultivos de callos de C. filaginoides con la finalidad de ofrecer nuevas alternativas biotecnológicas que permitan obtener rendimientos controlados de compuestos bioactivos de interés industrial presentes en la especie. La primera parte del desarrollo consistió en establecer las condiciones de germinación para la obtención de plántulas bajo condiciones asépticas, a partir de semillas de la especie aplicando 3 métodos de desinfección, posteriormente se indujeron a callogénesis explantes de hoja y pecíolo de de plántulas de 2 meses de edad mediante un diseño experimental de 16 tratamientos que consistió en colocar los tejidos vegetales (explantes) en medio de cultivo MS (Murashige & Skoog) suplementado con diferentes combinaciones de 2 grupos diferentes de reguladores de crecimiento vegetal (RCV): auxinas y citoquininas manteniendo los cultivos bajo condiciones de incubación de 25 ± 2 °C con un fotoperiodo de 16 h luz/ 8h oscuridad. Los parámetros evaluados fueron porcentaje (%) de callogénesis y friabilidad a los 24 de días de cultivo. Los tratamientos 6 (0.1 mg/L KIN + 1 mg/L PIC) y 14 (0.1 mg/L BAP + 1 mg/L PIC) mostraron sobresaliente respuesta de % callogénesis con características morfológicas deseables (apariencia friable sin oxidación y mayor crecimiento celular) en ambos explantes (hoja y pecíolo). Finalmente, mediante la técnica de cromatografía en capa fina con un sistema de elusión de CH2Cl2: MeOH (95:05), se encontró que los extractos de diclorometano-metanol (1:1) obtenidos de biomasa de cultivo de callo de hoja de los tratamientos 2, 3, 6 y 14 presentaron el perfil fitoquímico más amplio y similar al de planta silvestre. Estos extractos se analizaron mediante cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (CG-MS), identificando tres triterpenos pentacíclicos (lupeol, α-amirina, β-amirina) en el tratamiento 3 (0.1 mg/L KIN + 0.1 mg/L 2,4-D). De lo anterior, se puede decir que el cultivo in vitro de C. filaginoides produce compuestos de la misma naturaleza que la planta silvestre. Cabe resaltar que estos compuestos son de gran interés farmacológico por su actividad hepatoprotectora, antihiperglucémica e hipolipidémica, entre otras, por lo cual en las últimas décadas se ha enfocado la atención en la producción de los mismos mediante diferentes estrategias tecnológicas incluyendo la biotecnología vegetal. La principal contribución del presente trabajo fue el establecimiento de una nueva alternativa para la producción de compuestos bioactivos de interés farmacológico a partir de la especie C. filaginoides, cabe resaltar que es la primera vez que se registra la obtención de los tres triterpenos lupeol, α-amirina y β-amirina usando una misma combinación de RCV mediante la técnica de cultivo in vitro de plantas, por lo cual, tal hallazgo puede ser una gran aportación para la optimización en la producción comercial de tales compuestos o bien proporcionar información a futuras investigaciones y disciplinas como la ingeniería metabólica y genética encaminadas a la obtención y mejoramiento en la producción de estos compuestos y sus derivados por medio de una misma línea celular in vitro.
Conyza filaginoides is a plant native to Mexico, commonly known as “simonillo”, and in the Aztec language as “zacachichic”. In contemporary Mexico it is widely marketed as a crude medicine to prepare infusions and other phytomedicines (extracts, capsules or tablets), for this reason in recent years there have been numerous phytochemical studies of the wild species, which have made it possible to identify the presence of bioactive compounds with various pharmacological properties, validating its use as a medicinal plant; however, the growing interest in this species has derived in its overexploitation, significantly limiting its spread and distribution at a geographical level, leading it to be considered a species at risk of extinction. For this reason, it is important to search for new alternatives which allow satisfying the commercial demand of this medicinal specie, with the aim of take care of its ecological preservation at the same time. In this context, in vitro culture is an excellent option to obtain a greater bio-availability and final yield of the plant biomass, in addition to the fact that under controlled growing conditions applied, by means of biotechnological techniques, it is possible also to obtain a greater amount of bioactive compounds (secondary metabolites) of pharmacological and industrial interest. The present work aimed to establish the conditions of in vitro callus culture of C. filaginoides with the objective of offering new biotechnological alternatives that allow obtaining greater final yields of plant’s biomass as well its bioactive compounds of industrial and pharmacological interest present in this species. Experimental development of this project consisted firstly in establishing germination conditions of seedlings from seeds of this species, applying 3 different disinfection methods; later, seedlings of 2 months of age, obtained from leaf and petiole explants were induced to callogenesis through an experimental design of 16 diverse treatments, that consisted in placing the plant tissues in MS culture medium (Murashige & Skoog) supplemented with different combinations of 2 different groups of plant growth regulators (PGR's): auxins and cytokinins, keeping cultures under incubation conditions of 25 ± 2°C, with a photoperiod of 16 h light / 8 h dark, where the evaluated parameters were percentaje (%) of callogenesis and friability on day 24 of culture. Treatments 6 (KIN 0.1 mg/L + PIC 1 mg/L) and 14 (BAP 0.1 mg/L + PIC 1 mg/L) showed an outstanding response of % callogenesis, with desirable morphological characteristics (friable appearance without oxidation and high cell growth) in both explants (leaf and petiole). Finally, from dichloromethane-methanol extracts (1: 1), obtained from dried and finely grounded biomass of each combination (16 treatments), it was observed that treatments 2, 3, 6 and 14 of the leaf explant, contained the most complex phytochemical profile, similar to that showed by wild plants, this was achieve by means of thin layer chromatography with an elution system of CH2Cl2: MeOH (95:05). Extracts of these last treatments were analyzed through gas chromatography technique coupled to mass (CG-MS), identifying the presence of three pentacyclic triterpenes (lupeol, α-amirin, β-amirin) in treatment 3 (KIN 0.1 mg/L and 2,4-D 0.1 mg/L) extract, allowing to conclude that the cultures in vitro of this species produced compounds of the same nature, as those identified in the wild plant. It is important to mention that such compounds are of great pharmacological interest due to their hepatoprotective, antihyperglycemic and hypolipidemic activity, among others, which is why in recent decades attention has been focused on their production through different techniques strategies including plant biotechnology. The main contribution of this work was the establishment of a new alternative for the production of bioactive compounds of pharmacological interest from C. filaginoides, it should be noted that it is the first time that the obtaining of three triterpenes, lupeol, α-amyrin, and β-amyrin through the same combination of PGR's mixed for in vitro plant culture technique, for this reason such a finding can be a great contribution in the optimization for the commercial production of such compounds or provide information for future research and disciplines, such as metabolic and genetic engineering aimed to obtaing and improve the production of these compounds and their derivatives in the same in vitro cell line.
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