Estudio de la función de la subunidad α Aga1 sobre la biosíntesis de cefalosporina en Acremonium chrysogenum Público Deposited
Acremonium chrysogenum es un hongo filamentoso del grupo de los Ascomicetos, usado a nivel industrial en la producción de cefalosporina C, un antibiótico de la familia de los beta-lactámicos. La cefalosporina C ha demostrado ser activa frente a bacterias Grampositivas y Gram-negativas, y se sintetizan a partir de la misma derivados semisintéticos que se utilizan principalmente como antibióticos de amplio espectro. En el presente trabajo se estudiaron dos aspectos relacionados con la producción de cefalosporina en A. chrysogenum: 1) cómo afecta la expresión heteróloga del regulador global del metabolismo secundario LaeA la producción de cefalosporina C, y 2) el papel de la vía de transducción de señales de las proteínas G heterotriméricas en la biosíntesis de cefalosporina C. El regulador LaeA forma parte del complejo velvet de los hongos filamentosos, que regula procesos como la esporulación. La función específica de LaeA es la regulación global del metabolismo secundario, actuando probablemente mediante remodelación de la cromatina. Se obtuvieron transformantes de Acremonium chrysogenum con el gen laeA de Aspergillus terreus, y se analizó la producción de cefalosporina en los mismos. En varios de los transformantes se obtuvieron aumentos significativos de los niveles de producción, si bien no pudo corroborarse la presencia del gen en los transformantes mediante PCR. Las proteínas G heterotriméricas constan de tres subunidades: , y , y su ciclo de activación/inactivación está regulado por la subunidad G, la cual es una GTPasa. Cuando G se encuentra unida a GDP las tres subunidades están unidas y la vía está inactiva. El intercambio de GDP por GTP separa la subunidad G del dímero G para activar la vía, que vuelve a quedar inactiva por la hidrólisis de GTP a GDP causada por la actividad GTPasa de G, uniéndose entonces nuevamente las tres subunidades para formar el trímero inactivo.
En hongos filamentosos esta vía regula procesos como el desarrollo, conidiación, virulencia en especies patógenas, y el metabolismo secundario (pigmentos, toxinas, antibióticos). Recientemente en nuestro laboratorio se ha clonado el gen codificante de una subunidad G de Acremonium chrysogenum, al que se ha dado el nombre de aga1. En este trabajo se realizaron ensayos de producción de cefalosporina de cepas de A. chrysogenum que expresan un alelo mutado de aga1, el cual codifica una subunidad G constitutivamente activa (Aga1G42R), y en cepas que expresan un alelo mutado que codifica una subunidad G constitutivamente inactiva (Aga1G203). Se realizaron así mismo análisis de PCR tiempo real (RT-qPCR) del gen cefD1, perteneciente a la ruta de biosíntesis de cefalosporina C, con el propósito de analizar la expresión relativa de dicho gen en las cepas G42R y G203R respecto a la cepa control WT. Tanto en los bioensayos de producción de cefalosporina como en el análisis de expresión de cefD1 se observó que las cepas G203R no expresaban el gen y por tanto no produjeron antibiótico. Las cepas G42R presentaron una expresión relativa del gen cefD1 ligeramente menor que el control WT, y la producción de beta-lactámicos también fue ligeramente menor en los bioensayos. Las cepas control (WT y PC43) y las cepas G42R presentaron mayor producción a las 48 h, y en medio de cultivo tamponado a pH 7.0-7.5 se logró prolongar la producción hasta las 120 h. Las cepas G203R presentaron una morfología micelial muy diferente al control y la cepa G42R, presentando una elevada esporulación en medio sólido.
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