Identificación de extractos de fuentes naturales con actividad inhibitoria de tirosinasa Public
La tirosinasa es la enzima clave de la melanogénesis en la cual el producto final es la melanina. La melanina es la responsable de proteger la piel contra el daño inducido por luz ultravioleta, pero el exceso de producción de melanina está relacionado con trastornos dermatológicos tales como la hiperpigmenación post-inflamatoria y melasma. Por ello en la industria cosmética se han buscado inhibidores de tirosinasa para dar tratamiento a estos padecimientos de la piel, pero muchos de ellos no han mostrado ser eficientes. La Hidroquinona (HQ) es uno de los inhibidores sintéticos más eficientes, sin embargo se ha visto que la actividad inhibitoria de tirosinasa se debe a la destrucción de los melanocitos, por lo que es considerada como citotóxica y su uso es muy limitado, solo para tratamientos de melasma. En al caso de inhibidores de fuentes naturales se ha encontrado que son poco estables con la formulación y/o tienen poca penetración en la piel por lo que sus efectos son muy lentos. Estudios previos han mostrado que el uso de extractos de plantas (hoja, tallo y fruto) tienen actividad inhibitoria de tirosinasa la cual se ha relacionado con la presencia de polifenoles. La actividad inhibitoria también ha sido relacionada con la capacidad quelante del ion Cu²⁺ (CuCA), ya que la tirosinasa tiene en su sitio activo este metal que favorece la oxidación de su sustrato (L-tirosina) y así desencadenar la serie de reacciones que forman la melanina. Por ello el objetivo de este estudio es probar diferentes extractos de fuentes naturales como potenciales inhibidores de tirosinasa y evaluar su capacidad quelante de Cu²⁺, tales como las proteínas e hidrolizados del grano de amaranto (Amaranthus hypochondriacus), hidrolizados del material lignocelulósico del tallo de amaranto y extractos de las diferentes plantas de muérdago Cladocolea loniceroides. Los cuales han mostrado tener gran cantidad de polifenoles. Para ello fueron aisladas la albúmina 1, globulina y glutelinas del grano del amaranto, posteriormente fueron liofilizadas e hidrolizadas con alcalasa (E/S = 0.8 UA/g proteína; pH 7.4; T = 50°C) a diferentes tiempos (3, 21, 30, 36 y 48 h). Para conocer el avance de la reacción se midió el grado de hidrolisis con la reacción de TNBS la cual se fundamenta con la cuantificación de los grupos amino libres. La actividad de la tirosinasa fue medida utilizando L-tirosina (1 mg/ml), tirosinasa de champiñón (Sigma-Aldrich T3824-50KU) 96 U/ml y las muestras en DMSO al 5%.
La reacción fue monitoreada por la formación de dopacromo (cromóforo estable que absorbe a λ=475 nm), cada minuto durante un periodo de 10 mín. La albúmina 1, globulina y glutelina no fueron utilizadas como sustrato por la tirosinasa, resultados similares fueron encontrados en caseína y ovoalbúmina, por lo que se esperaría que fueran potenciales inhibidores de la enzima. Sin embargo todas estas proteínas no tienen actividad inhbitoria de tirosinasa, por el contrario mejoran su actividad. Todos los hidrolizados de las proteínas del amaranto, caseína y ovoalbúmia también incrementaron la actividad. Todos los hidrolizados de las proteínas del amaranto fueron separados por filtración en gel (Sephadez G-15) de los cuales solo rindieron una fracción de 0.8 kDa obtenida de albúmina 1, la cual pudo inhibir la actividad en 25±2.29 %. Esta propiedad fue explicada por la baja capacidad quelante de Cu²⁺ la cual no fue suficiente para inhibir la actividad de la tirosinasa. La actividad inhibitoria de tirosinasa de la fracción de 0.8kDa no fue dependiente de la concentración (0.027 – 0.16 mg/ml). En el caso de los hidrolizados del material lignocelulósico del tallo de amaranto, no se mostró efecto de inhibición ni de activación, sin embargo dichos hidrolizados presentan capacidad quelante de Cu²⁺, lo cual podría indicar que la CuCA no necesariamente está relacionada con la actividad inhibitoria de tirosinasa. En el estudio con la planta de muérdago Cladocolea loniceroides (Frutos verdes y maduros, hoja y tallo) utilizando diferentes solventes (agua, etanol, metanol, acetato de etilo, cloroformo y hexano), para la obtención de extractos, se logró obtener la mayor cantidad de polifenoles con agua, etanol y metanol. Siendo en estos mismos solventes en donde se presentó la mayor actividad inhibitoria de tirosinasa Etanol - Fruto Verde (75.26±0.25 %), Agua - Fruto Maduro (76.14±0.57 %), Metanol -Tallo (90.49±1.96 %). Confirmando que la actividad inhibitoria de tirosinasa podría estar muy relacionada con la presencia de compuestos polifenólicos. Todos los extractos presentan buena capacidad quelante de Cu²⁺, sin embargo al realizar el ensayo de la cinética al extracto acuoso de muérdago que fue el que presentó el menor valor de IC ₅₀ (0.34 mgeq.Ác. Gálico/ml), se encontró que presenta inhibición no competitiva. Por lo que los extractos no compiten con el sustrato por el sitio activo, uniéndose a otro sitio de la enzima. Posiblemente no puedan entrar al sitio activo por impedimento estérico, como ocurrió en el caso de los hidrolizados de las proteínas del grano de amaranto, ya que los hidrolizados no lograron inhibir la actividad de la tirosinasa pero al fraccionar los hidrolizados se obtuvieron péptidos de menor tamaño que lograron inhibir la actividad en 25±2.29 %.
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