Identificación de la enzima responsable de la degradación de pentaclorofenol (PCF) en Amylomyces rouxii y optimización del mecanismo de degradación mediante la expresión heteróloga de peroxidasas Pubblico Deposited
Toxic, recalcitrant and xenobiotic compounds are highly increased in the environment, reason there are many studies about degradation processes of these compounds. One of such xenobiotic important as a model, is pentachlorophenol (PCP), produced during manufactured process of paper. There are physical and chemical methods to degrade the toxic, but these processes have some disadvantages, as high cost and not desirables by-products. Biodegradation is an alternative process, in which method microorganisms able to degrade the toxic are used, these microorganism normally produce ligninolytic enzymes (Mn-peroxidase, Li-peroxidase and lacase). These enzymes oxidizes phenolic compounds, but the producer microorganisms shows a very slow growth. We are interested in to look for an use microorganisms able to degrade toxic through different enzymatic sistems, showing a better growth and that could be improved by heterologous expression of peroxidase enzymes from ligninolytic fungi. Amylomyces rouxii was isolated from paper industry effluent. A. rouxii tolerate and degrade PCP (52% in 168 h). Initial studies showed that this fungus did not produce peroxidases (LiP and MnP), altougth phenoloxidases were found by qualitative assays. Tyrosine, a specific substrate for tyrosinase, was added to fermentation medium and PCP degradation capacity was increased in 30% (81% in 168h). This strongly supported that a tyrosinase will be the enzyme responsible for PCP degradation by this fungus. In this work, the enzyme responsible for PCP degradation by A. rouxii was determined and degradation capacity was improved by heterologous expression. First we made a partial purification of fermentation extract. The enzyme from this extract presented monophenolase activity and a molecular weight, 40 KDa, similar to a commercial tyrosinase used as standard. A. rouxii was co-transformed with pVEM and pCGM and pVEL and pCGL plasmids containing manganese and lignin peroxidase genes from Phanerochaete chrysosporium respectively and with pULC43 and pAN7-1 plasmid containing resistance to phleomycin and hygromycin genes (used as markerfor the first selection of transformants). The second selection was made by decoloration capacity of Poly R-478, this pigment is decolorated by peroxidases but not by phenoloxidases. It was obtained three transformant strains degrading 100% of PCP in 144 h of fermentation.
Debido a la creciente presencia de compuestos tóxicos, xenobióticos y recalcitrantes, muchos grupos de investigación se han interesado por conocer alguna forma de degradarlos. Hasta el momento existen tratamientos físicos y químicos capaces de hacerlo, aunque presentan el inconveniente de un alto costo y formación de otros productos indeseables. También existen procesos biotecnológicos que utilizan microorganismos, algunos de los cuales cuentan con complejos enzimáticos capaces de degradar este tipo de tóxicos. Entre los xenobióticos más comunes se encuentra el pentaclorofenol (PCF), que se forma durante el proceso de manufactura del papel. Se ha encontrado que hongos pertenecientes al grupo de los basidiomicetos poseen enzimas ligninolíticas (MnP, LiP y lacasa) que oxidan compuestos fenólicos. A pesar de los beneficios que nos ofrecen estas enzimas, los microorganismos que las producen son de lento crecimiento. Podría especularse, por lo tanto, con la posibilidad de utilizar microorganismos propios de dichos efluentes, que además crezcan más rápido y posean la capacidad de degradación de PCF, con la opción de ser optimizados mediante la expresión heteróloga de enzimas peroxidasas de otras especies. Por tales razones, en este trabajo se usó una cepa de Amylomyces rouxii, aislada de un efluente de la industria del papel y que tiene la capacidad de tolerar y degradar el PCF (52% en 168 h). Pruebas iniciales muestran que este hongo no posee enzimas peroxidasas (MnP y LiP), aunque en pruebas de tipo cualitativo se observa actividad de fenoloxidasas. Por medio de ensayos de fermentación con adición de tirosina, un substrato específico para una fenoloxidasa (tirosinasa), se logró incrementar en un 30% la capacidad de degradación del PCF (81% en 168 h), lo que nos da pauta a considerar que es una tirosinasa la principal enzima responsable de la degradación del PCF en este hongo. ras la purificación parcial del extracto de fermentación se pudo obtener una enzima con actividad monofenolasa (reacción que solo se apreció con tirosinasa comercial y no con lacasa o peroxidasa). Dicha enzima posee, aproximadamente, el mismo peso molecular que una tirosinasa comercial (40 KDa). La tirosinasa comercial por sí sola, fue capaz de degradar el PCF. Todos estos datos llevan a concluir que es una tirosinasa la enzima responsable de la degradación del PCF. Por otro lado fue posible optimizar el mecanismo de degradación del hongo por cotransformación con los plásmidos pVEM y pCGM y pVEL y pCGL que contienen los genes de Manganeso peroxidasa y Lignina peroxidasa de Phanerochaete chrysosporium, respectivamente y los plásmidos pULC43 y pAN7-1 que poseen genes de resistencia a fleomicina e higromicina, respectivamente (utilizados como marcadores en la primera selección de transformantes). Una segunda selección se realizó analizando la capacidad de las colonias para decolorar el polímero Poly R-478, reportado como uno de los colorantes que las peroxidasas son capaces de decolorar. Se lograron obtener 3 cepas transformantes que fueron capaces de degradar el PCF en su totalidad en 144 h de fermentación líquida. Por último y como dato adicional, no se consiguió amplificación con PCR utilizando cebadores para lacasa, mientras que sí se obtuvo con cebadores para tirosinasa.
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