Estudio del efecto de doce compuestos activos farmacéuticos en el crecimiento radial de Amylomyces rouxii Public
Actualmente existe la presencia de contaminantes emergentes en el medio ambiente, entre estos contaminantes se encuentran los compuestos farmacéuticos activos (PhACs) presentes en concentraciones de nanogramos por litro hasta microgramos por litro. La presencia de PhACs puede deberse a procesos de contaminación puntual o difusa y su transporte depende de las propiedades de cada compuesto. Los PhACs pueden llegar a las aguas superficiales, afectando a organismos acuáticos, a aguas subterráneas e inclusive al agua potable. Dado el daño ecológico que causan los fármacos es importante investigar alternativas para su remoción y/o degradación. La remoción de PhACs del medio ambiente por procesos biológicos es una alternativa económica y amigable con la naturaleza; por ejemplo, el uso de hongos filamentosos como A. rouxii. En este trabajo se evaluó la capacidad de A. rouxii para crecer en presencia de doce fármacos: carbamazepina (CBZ), paracetamol (PCT), sulfametoxazol (SMX), trimetoprima (TRP), ibuprofeno (IBP), β-estradiol (βETD), ciprofloxacino (CPX), ofloxacino (OFX), diclofenaco (DFC), naproxeno (NPX), triclosán (TRC) y bisfenol A (BSFA) a concentraciones entre 100 a 5000 μg L-1. El hongo se creció en placas de agar Lee en presencia de las diferentes concentraciones de PhACs y se midió el crecimiento radial del micelio a diferentes tiempos. La presencia de los PhACs a diferentes concentraciones modificó la morfología del hongo y el tiempo de esporulación. Los valores de las velocidades máximas (Vmax) se obtuvieron mediante regresión lineal de los datos de la fase exponencial del crecimiento radial de A. rouxii. Con la ecuación logística se modeló el crecimiento exponencial y la fase estacionaria de A. rouxii y se determinó la velocidad máxima específica de crecimiento (μmax) y el crecimiento máximo del hongo. El análisis de regresión lineal aplicado a los datos cinéticos de crecimiento indicó que la Vmax de A. rouxii crecido en presencia de los PhACs no mostró diferencia significativa, excepto para los tratamientos con DCF, CBZ y βETD. El análisis de regresión no lineal aplicado a los datos cinéticos de crecimiento indicó que no hubo diferencia significativa (p-valor > 0.05) en los valores de μmax calculados para los cultivos control y en presencia de los PhACs; independientemente de la concentración probada. El perfil de crecimiento de A. rouxii en los cultivos control presentó una curva de crecimiento sigmoidal con buen ajuste al modelo logístico (R2 >0.975). Los doce PhACs mostraron un buen ajuste al modelo logístico para los cultivos con 100, 250, 1000 y 1500 μg L-1, excepto para los cultivos con 100 μg L-1 de IBP, donde los datos no se ajustaron bien al modelo dada la alta variación experimental. El crecimiento radial de A. rouxii presentó un buen ajuste al modelo logístico en presencia de 2500 μg L-1, excepto en los cultivos con CBZ y PCT donde se observó que el crecimiento radial del hongo no se ajustó bien al modelo logístico (R2 <0.975). El perfil del crecimiento de A. rouxii en presencia de 5000 μg L-1 de BSFA, CPFX, IBP, PCT, OFX y TRC presentó un buen ajuste al modelo logístico. Sin embargo, en presencia de 5000 μg L-1 de βETD, TRP, SMX, NPX y DFC los datos de crecimiento radial se ajustaron mal al modelo logístico (R2 <0.975). A. rouxii no creció en presencia de 5000 μg L-1 de CBZ. El perfil del crecimiento radial de A. rouxii mostró una fase lag en todos los cultivos. En el cultivo control tuvo una duración de 3 h, mientras que los cultivos con presencia de PhACs, la fase lag presentó una duración de 6 a 14 h, dependiendo del PhAC y la concentración del fármaco. A. rouxii alcanzó su crecimiento máximo. 45 mm. a las 44 h de cultivo, y éste no se vio afectado por la presencia de PhACs en ninguna concentración probada; excepto en los cultivos con 5000 μg L-1 de CBZ. La inhibición del crecimiento radial causada por la presencia de los PhACs se calculó con los datos de la fase exponencial a las 24 de h. Se utilizó un diseño completamente al azar de un solo factor con pruebas Post Hoc de HDS de Tukey y Games-Howell para demostrar el efecto de la concentración de los PhACs sobre la inhibición del crecimiento radial de A. rouxii. El hongo mostró sensibilidad por la presencia de DFC, TRC y NPX. En estos cultivos se observó una relación lineal entre la concentración y la inhibición de crecimiento radial; a mayor concentración de DFC, TRC y NPX, mayor porcentaje de inhibición se observó. En contraste, las diferentes concentraciones de IBP, TRP y βETD no causaron un efecto en la inhibición del crecimiento radial, no hubo diferencia significativa en el porcentaje de inhibición con todas las concentraciones probadas. Para los cultivos con CPFX, BSFA, OFX, SMX y PCT no se observó una relación entre la concentración del fármaco y la inhibición; es decir, no en todas las concentraciones probadas de fármacos se observaron diferencias significativas en los porcentajes de inhibición. A rouxii mostró una alta sensibilidad a 5000μg L-1 de CBZ, ya que, a dicha concentración, el crecimiento radial de A. rouxii se inhibió completamente.
Emergent pollutants are present in the environment, between these are the pharmaceutical active compounds (PhACs) found at concentrations of nanograms to milligrams per liter. The presence of PhACs may be due to point or diffuse contamination and their transport depends on the properties of each compound. The occurrence of PhACs is into the superficial water, affecting aquatic organisms, the ground water and drinking water. Due to the ecologic damage caused by the pharmaceuticals, it is important propose removal and degradation processes. Biological process to remove PhACs is an economic and environment friendly alternative, by example the use of filamentous fungi. In this work it was evaluated the capacity of Amylomyces rouxii to grow in presence of twelve pharmaceuticals at concentrations between 100 to 5000 μg L-1. The PhCAS were carbamazepine (CBZ), paracetamol (PCT), sulfamethoxazole (SMX), trimethoprim (TRP), ibuprofen (IBP), β-estradiol (βETD), ciprofloxacin (CPX), ofloxacin (OFX), diclofenac (DFC), naproxen (NPX), triclosan (TRC) and bisphenol A (BSFA). The fungus was grown on Lee-agar medium containing the different concentrations of PhACs. The plates were incubated at 30°C for 48 h. Fungal radial growth were measured at different times. The presence of PhACs in medium culture modified the morphology and sporulation time of fungus. The values of the maximum velocities (Vmax) were obtained by linear regression of the data of the exponential phase of the radial growth of A. rouxii. The data of A. rouxii radial growth were modeled with the logistic equation and were obtained the exponential and stationary phases, the specific growth maximal rate (μmax) and de maximal growth. The linear regression analysis applied to the growth kinetic data indicated that the Vmax of A. rouxii cultivated in the presence of the PhACs did not show a significant difference, except for the treatments with DCF, CBZ and βETD. Nonlinear regression analysis applied to growth kinetic data indicated that μmax values calculated did not presented significant difference (p- value > 0.05) between the control culture and the cultures with PhACs, independently of their assayed concentrations. The profile growth of A. rouxii in control cultures presented a sigmoidal curve and data fitted good at logistic model (R2 >0.975). The data of radial growth from the cultures with the twelve PhACs at 100, 250, 1000 and 1500 μg L-1 fitted good at logistic model, except the culture with IBP because the experimental variation of data was too high. In cultures with 2500 μg L-1 of PhACs the A. rouxii radial growth fitted good to the logistic model except the growth in presence of CBZ and PCT where growth was not fitted (R2 <0.975). The profile growth of A. rouxii with 5000 μg L-1 of BSFA, CPFX, IBP, PCT, OFX and TRC presented a sigmoidal growth curve and data fitted good with logistic equation. In contrast, in presence of 5000 μg L-1 of βETD, TRP, SMX, NPX and DFC the data of radial growth did not fit at logistic model (R2 <0.975). Finally, in cultures with 5000 μg CBZ L-1 A. rouxii did not grow. A. rouxii presented a lag phase in all cultures. In the control the lag phase was 3 h, while in cultures with PhACs lag phase was between 6 to 14 h according to the type and concentration of the compound. The maximal growth was achieved at 44 h, CRmax= 45 mm in cultures with or without PhACs, except with 5000 μg L-1 of CBZ. The presence of PhACs affected the radial growth of A. rouxii at the exponential phase, 24h, the inhibition was calculated with the data of exponential phase at this time. A one-factor completely randomized design was used with Tukey and Games-Howell HDS Post Hoc test to show the inhibitory effect of A. rouxii growth due to the PhACs concentration. Fungus was sensible to DFC, TRC and NPX, there was observed a linear relation between concentration and inhibition of radial growth. At higher DFC, TRC and NPX concentration, the inhibition was greater. In contrast, there was not found significant difference in the radial growth inhibition at the different essayed concentrations of IBP, TRP y βETD. In the cultures with CPFX, BSFA, OFX, SMX and PCT there was not observed a relation between the pharmaceutical concentration and the radial growth inhibition. Only with some concentrations was observed significant difference in the percent of inhibition. The higher sensibility of A. rouxii was to the presence of CBZ, at 5000 μg L-1 the growth of fungus was completely inhibited.
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