Efecto de la vitrificación en la fertilización y desarrollo embrionario in vitro de ovocitos inmaduros porcinos Pubblico Deposited
Introducción: La mayoría de los estudios cuyo objetivo es evaluar las tasas de recuperación y desarrollo post-vitrificación de ovocitos porcinos han reportado mejores tasas cuando estos son criopreservados en estados embrionarios, pero no así en ovocitos inmaduros. Por esta razón, para mejorar los protocolos de la vitrificación de ovocitos inmaduros, se ha evaluado el uso de diferentes tipos y concentraciones de crioprotectores, recipientes, y tiempos de incubación, pero muy pocos han evaluado cual técnica de fertilización permite incrementar las tasas de producción de blastocistos en ovocitos vitrificados. El objetivo de esta tesis fue evaluar el desarrollo embrionario hasta el estado de blastocisto a partir de ovocitos inmaduros vitrificados madurados con un sistema de co-cultivo con células de la granulosa y fertilizados por fertilización in vitro (FIV), inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI) e inyección fisiológica intracitoplasmática de espermatozoides (PICSI). Así como, evaluar si la selección espermática con ácido hialurónico (AH) o con polivinilpirrolidona (PVP) antes de la inyección intracitoplasmática participan en forma importante en el incremento de las tasas de fertilización y producción de blastocistos. Resultados: Los espermatozoides seleccionados con AH-PICSI mostraron un mayor porcentaje de espermatozoides vivos/reaccionados en comparación con el control y los expuestos a la PVP. Altas tasas de espermatozoides muertos/reaccionados se obtuvieron después de la exposición a la PVP en comparación con el control y el AH. En ovocitos, la viabilidad disminuyó significativamente en el control de ovocitos denudados (DO) y en ovocitos vitrificados. Además, la maduración disminuyó significativamente en el control DO. En cuanto a los parámetros de fertilización, la FIV mostró mayores porcentajes de monospermia en comparación con la ICSI y la PICSI. Sin embargo, los resultados demostraron que la fertilización con PICSI incrementó la formación de blastocistos en los grupos control complejo ovocito-células del cúmulo (COCs), control ovocitos denudados co-cultivados con células de la granulosa (DO-GC) y ovocitos vitrificados en comparación con la FIV e ICSI. Conclusión: Para lograr altas tasas de formación de blastocitos a partir de ovocitos vitrificados en etapa de vesícula germinal (VG), se recomienda que el espermatozoide se seleccione antes de ser inyectado al ovocito con AH en lugar de la PVP, debido a que se obtienen mayores tasas de viabilidad y reacción acrosomal. Además, la fertilización por PICSI es el mejor método para producir mayores tasas de blastocistos en comparación con los procedimientos de FIV e ICSI.
Background: Most studies carried out to evaluate porcine oocyte recovery and development after vitrification, have reported better rates when cryopreserved in embryonic development stages or in zygotes, but not in immature oocytes. For this reason, many studies have been performed to improve immature oocyte vitrification protocols testing the use of different cryoprotectant concentrations, cooling devices, and incubation times, but only a few of them have evaluated which fertilization procedure enhances blastocyst rates in vitrified oocytes. Therefore, this study was aimed to evaluate the embryo developmental ability and blastocyst production of porcine immature oocytes retrieved after vitrification-warming and matured with a granulose cell co-culture system, using different fertilization techniques: in vitro fertilization (IVF), intracytoplasmic sperm injection (ICSI) and physiological intracytoplasmic sperm injection (PICSI), as well as to evaluate if the sperm selection with hyaluronic acid (HA) or polyvinylpyrrolidone (PVP) before injection could play a key role increasing fertilization and blastocyst formation. Results: Sperm selected with HA-PICSI displayed a higher percentage of live/acrosome reacted status as compared to those in control (non-exposed oocytes) and exposed to PVP. Higher dead/acrosome reacted rates were obtained after PVP exposure compared to control and HA. In oocytes, viability was significantly decreased after in vitro maturation (IVM) in control denuded oocytes (DO) and vitrified oocytes. Besides, maturation significantly decreased in control DO. Regarding fertilization parameters, IVF showed higher percentages of monospermy than those obtained by ICSI and PICSI. However, results demonstrate that PICSI fertilization increased the blastocysts formation rate in control cumulus-oocyte complexes (COCs), control denuded oocytes cultured with granulosa cells (DO-GC) and vitrified oocytes compared to those by IVF and ICSI. Conclusions: To achieve high blastocyst formation rates from vitrified germinal vesicle (GV) oocytes, it is recommended that sperm should be selected with HA instead of PVP before injection since high viability and acrosome reaction rates are obtained. Also, PICSI fertilization is the best method to produce higher blastocyst rates than the IVF and ICSI procedures.
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