Vitrificación de ovocitos porcinos y su efecto a nivel estructural en embriones y en el ADN de las células del cúmulo Público Deposited
La vitrificación es una técnica que se utiliza principalmente para criopreservar embriones y gametos femeninos. Esta técnica permite mantener la viabilidad celular, la funcionalidad y el potencial de desarrollo a bajas temperaturas en nitrógeno líquido a -196 ºC. Para ello, se requiere de la adición de agentes crioprotectores (CPAs), que son sustancias que brindan protección celular durante el enfriamiento y el calentamiento. Sin embargo, se ha informado que son potencialmente tóxicos, reduciendo la viabilidad de los ovocitos, la maduración, la fertilización y el desarrollo embrionario (DE), posiblemente alterando la estructura del citoesqueleto celular y de la cromatina (CR). Estudios previos han evaluado los efectos de la vitrificación de manera directa en ovocitos en vesícula germinal (VG), metafase II (MII), cigotos y blastocistos, pero el conocimiento de su impacto en el desarrollo posterior de los embriones es limitado. Otros estudios han evaluado el papel de los microfilamentos (MF) de actina y de la CR, basados en las tasas obtenidas de la fertilización y del DE, pero no la evaluación directa de estas estructuras en embriones producidos a partir de ovocitos inmaduros vitrificados. Por lo tanto, este estudio fue diseñado para evaluar cómo la vitrificación de ovocitos inmaduros porcinos afecta al desarrollo del embrión temprano mediante la evaluación de la distribución de MF de actina y la integridad de la CR. Los resultados demuestran que el daño generado por la vitrificación de ovocitos inmaduros afecta la viabilidad, la maduración, el DE, la distribución de MF de actina y la integridad de la CR observada en embriones tempranos, pero no afectó la fertilización in vitro. Por lo tanto, se sugiere que la vitrificación podría afectan los mecanismos de reparación de los ovocitos en esas estructuras, siendo uno de los mecanismos que explicar las bajas tasas de DE después de la vitrificación. 5203 Por otro lado, la evaluación del daño del ADN generado en las células del cúmulo (CC) después de la vitrificación de los complejos ovocitos-células del cúmulo (COCs) maduros puede considerarse como indicador de la calidad de los ovocitos, ya que estas células juegan un papel importante en la competencia del desarrollo de los ovocitos. Por lo tanto, el segundo objetivo de este estudio fue determinar si la exposición de los COCs maduros a CPAs o a la vitrificación afectan la viabilidad de los ovocitos y de las CC, además si se genera daño al ADN en las CC, afectando la fertilización y el DE. El daño del ADN en las CC se midió utilizando el ensayo cometa alcalino y se expresó como longitud de la cola del cometa (LCC) y el tiempo momento (OTM, por sus siglas en inglés). Los resultados demuestran que la exposición de los ovocitos a los CPAs (grupo toxicidad) o la vitrificación redujo la viabilidad de los ovocitos (75.5 ± 3.69 %, toxicidad; 66.7 ± 4.57 %, vitrificación) y de las CC (32.7 ± 5.85 %, toxicidad; 7.7 ± 2.21 %, vitrificación) en comparación con el control (95.5 % ± 4.04 %, ovocitos; 89 ± 4.24 %, CC). Además, se generó daño en el ADN significativamente mayor expresado como OTM en las CC después de la exposición a CPAs y vitrificación (39 ± 17.41, 33.6 ± 16.69, respectivamente) en comparación con el control (7.4 ± 4.22). Además, las tasas de fertilización y de DE también disminuyeron después de la exposición a CPAs (35.3 ± 16.65 %, 22.6 ± 3.05 %, respectivamente) y a la vitrificación (32.3 ± 9.29 %, 20 ± 1 %, respectivamente). Este estudio demuestra que la exposición de los ovocitos a los CPAs o a la vitrificación redujo la viabilidad de los ovocitos y de las CC y generó daños en el ADN de las CC, lo que afectó las tasas de fertilización y de DE. Estos hallazgos permitirán comprender algunos de los mecanismos de daño de los ovocitos tras la vitrificación que comprometen su capacidad de desarrollo, así como la búsqueda de nuevas estrategias de vitrificación para incrementar las tasas de fecundación y de DE preservando la integridad de las CC.
Vitrification is mainly used to cryopreserve embryos and female gametes. This technique allows maintaining cell viability, functionality, and developmental potential at low temperatures into liquid nitrogen at -196 ºC. For this, the addition of cryoprotectant agents, which are substances that provide cell protection during cooling and warming, is required. However, they have been reported to be toxic, reducing oocyte viability, maturation, fertilization, and embryo development, possibly by altering cell cytoskeleton structure and chromatin. Previous studies have evaluated the effects of vitrification in the germinal vesicle, metaphase II oocytes, zygotes, and blastocysts, but the knowledge of its impact on their further embryo development is limited. Other studies have evaluated the role of actin microfilaments and chromatin, based on the fertilization and embryo development rates obtained, but not the direct evaluation of these structures in embryos produced from vitrified immature oocytes. Therefore, this study was designed to evaluate how the vitrification of porcine immature oocytes affects early embryo development by the evaluation of actin microfilament distribution and chromatin integrity. Results demonstrate that the damage generated by the vitrification of immature oocytes affects viability, maturation, and the distribution of actin microfilaments and chromatin integrity, observed in early embryos, but did not affect in vitro fertilization. Therefore, it is suggested that vitrification could affect oocyte repair mechanisms in those structures, being one of the mechanisms that explain the low embryo development rates after vitrification. On the other hand, the evaluation of the DNA damage generated in cumulus cells after mature cumulus-oocyte complexes vitrification can be considered as an indicator of oocyte quality since these cells play important roles in oocyte developmental competence. Therefore, the aim of this study was to determine if matured cumulus-oocyte complexes exposure to cryoprotectants (CPAs) or vitrification affects oocytes and cumulus cells viability, but also if DNA damage is generated in cumulus cells, affecting fertilization and embryo development. The DNA damage in cumulus cells was measured using the alkaline comet assay and expressed as Comet Tail Length and Olive Tail Moment (OTM). Results demonstrate that oocyte exposure to CPAs or vitrification reduced oocyte (75.5 ± 3.69 %, toxicity; 66.7 ± 4.57 %, vitrification) and cumulus cells viability (32.7 ± 5.85 %, toxicity; 7.7 ± 2.21 %, vitrification) compared to control (95.5 ± 4.04 %, oocytes; 89 ± 4.24 %, cumulus cells). Also, significantly higher DNA damage expressed as OTM was generated in the cumulus cells after exposure to CPAs and vitrification (39 ± 17.41, 33.6 ± 16.69, respectively) compared to control (7.4 ± 4.22). In addition, fertilization and embryo development rates also decreased after exposure to CPAs (35.3 ± 16.65 %, 22.6 ± 3.05 %, respectively) and vitrification (32.3 ± 9.29 %, 20 ± 1 %, respectively). This study demonstrates that oocyte exposure to CPAs or vitrification reduced viability in oocytes and cumulus cells, and generated DNA damage in the cumulus cells, affecting fertilization and embryo development rates. These findings will allow to understand some of the mechanisms of oocyte damage after vitrification that compromise their developmental capacity, as well as the search for new vitrification strategies to increase fertilization and embryo development rates by preserving the integrity of the cumulus cells.
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