En el presente trabajo se estudió la importancia del residuo estrictamente conservado Cys126, perteneciente al sitio activo de la triosafosfato isomerasa (TIM), en la catálisis y estabilidad de la enzima. Para tal efecto, utilizamos dos enzimas mutantes de TIM de levadura de Saccharomyces cerevisiae (ScTIM), construidas mediante mutagénesis dirigida; en una se sustituyó la Cys por Ser (C126S) y en la otra por Ala (C126A), siendo estas sustituciones dos de las mas frecuentes para este tipo de residuo. Las tres enzimas mencionadas fueron purificadas usando el método previamente reportado para la TIM recombinante de levadura, lográndose purificar a homogeneidad. Los rendimientos de la C126A y C126S fueron menores (1.0 y 3.0 mg L-1, respectivamente) que el conseguido para la ScTIM (13.0 mg L-1). Todos los resultados de las enzimas mutantes fueron comparados con los obtenidos para la ScTIM. Primeramente, se determinó que las mutaciones no provocaron cambios estructurales significativos a juzgar por los espectros de dicroísmo circular (DC) tanto en la región del UV lejano (estructura secundaria) como en el UV cercano (estructura terciaria), así como por los de fluorescencia (estructura terciaria). Por otro lado, cuando las proteínas se incubaron con subtilisina, una enzima capaz de proteolizar a la TIM, se observó el mismo patrón de lisis para las tres enzimas, asimismo, no se observó proteólisis para ninguna de las variantes en presencia de papaína, quimotripsina y tripsina, por lo que podemos decir que las mutaciones no promueven nuevos sitos de proteólisis ante estas proteasas. Para estudiar el papel de la Cys126 en la catálisis, se determinaron los parámetros cinéticos utilizando los dos sustratos de la TIM: dihidroxiacetona fosfato (DHAP) y Dgliceraldehído-3 fosfato (DGAP). Con este último, tanto la C126S como la C126A presentaron una disminución de − K M (3.7 y 1.3 veces) y de − cat k (4.3 y 1.5 veces), respectivamente; en el caso de DHAP, la C126S mostró una disminución de 3.5 ( + K M ) y de 8.3 ( + cat k ) veces, respecto a la enzima silvestre. Ya que tanto kcat como KM disminuyen, la eficiencia catalítica (KM/kcat) de las enzimas mutantes es semejante a la encontrada en la ScTIM. Los valores de la constante de unión (Ku) para el análogo de sustrato 2-fosfoglicolato (PGA), determinados por tres métodos diferentes (cinético, titulación fluorométrica y microcalorimetría de titulación isotérmica), dejaron ver una mayor afinidad por el PGA por parte de las enzimas mutantes, lo que concuerda con lo observado para la KM; tal incremento fue de 1.4 a 3.0 veces respecto a la ScTIM. El análisis termodinámico de la unión muestra que la mayor afinidad de las mutantes por el PGA se debe principalmente a una contribución entrópica menos desfavorable, lo que pudiera ser explicado con una mayor desolvatación cuando las mutantes unen al sustrato. La importancia del residuo 126 en la estabilidad de la TIM se exploró por desnaturalización térmica; los perfiles de desplegamiento por DC de las enzimas C126A y C126S mostraron un corrimiento de la Tm aparente de 9 y 13 o C, respectivamente, comparada con el valor de la ScTIM. Además, sólo se replegaron en un 65–70% en las mismas condiciones donde la TIM silvestre se replegó más del 95%. Las constantes cinéticas de desplegamiento (kd) y de replegamiento (kr) se determinaron por DC a diferentes temperaturas a pH 7.4 y 8.5. A partir de estos datos estimamos que, a 25 o C, la C126A y la C126S son menos estables que la ScTIM por aproximadamente 5.0 y 9.0 kcal mol-1, respectivamente. Finalmente, a partir de la comparación de las dinámicas moleculares de la ScTIM y las dos mutantes de Cys126, pudimos observar que en el caso de la C126A los residuos catalíticos mantienen interacciones y distancias parecidas a las presentes en la ScTIM, lo que no sucedió con la C126S. En el caso de las interacciones con moléculas de agua, nuevamente la C126S presenta menos interacciones que la ScTIM, lo que pudiera ser indicio de mayor movilidad de dichas moléculas que daría como resultado una enzima más deshidratada al unir el sustrato, lo que apoyaría el aumento en la entropía de unión del PGA (∆Su) observado para dicha mutante. Si la TIM trabaja in vivo en condiciones lejanas a la saturación, como ha sido reportado, y con base a los resultados obtenidos en el presente trabajo, podemos decir que la Cys126 es requerida tanto para la estabilidad como para el plegamiento eficiente de la TIM más que para su catálisis.
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