Efecto de exosomas derivados de mamosferas y líneas celulares de cáncer de mama bajo un estímulo pro-inflamatorio por IL-6 e IL-8 en la angiogénesis Público Deposited
El cáncer de mama es una enfermedad de interés global por su alta tasa de incidencia y mortalidad. Actualmente es ampliamente utilizada la presencia de marcadores inmunohistoquimicos. En este trabajo nos centramos en el subtipo Luminal A (ER+/PR+/HER2-) ya que es el de mejor pronóstico y responde a tratamiento, y en el subtipo y estadio más agresivo Triple Negativo (ER-/PR- /HER2-) ya que es el de peor pronóstico y presenta metástasis. En la actualidad el sistema de cultivo de mamosferas es ampliamente utilizado para identificar y enriquecer a células troncales de cáncer de mama (BCSC) a partir de líneas celulares de cáncer de mama o tumores primarios de mama. Se ha reportado que esta población celular es la responsable del inicio y formación de tumores de mama. Cualquier tipo de cáncer se encuentra inmerso dentro de un microambiente tumoral, en el cual, los distintos tipos celulares producen y secretan citocinas inflamatorias como IL-6, quimiocinas como CXCL 8 (IL-8), metabolitos y microvesículas (exosomas). La Interleucina 6 (IL-6) juega un papel primario como mediador principal de la respuesta inflamatoria en la fisiopatología del cáncer. Se ha visto que algunas propiedades de BCSC pueden estar reguladas por la IL6.Esta citocina está elevada en tumores y sueros de pacientes con CM. La IL-8 es ampliamente estudiada como un potente mediador de la angiogénesis ya que está altamente expresada en los CM ER-, y aumenta la invasividad y el potencial metastásico de las células de cáncer de mama ER-. Dicho esto nos pareció interesante evaluar el efecto de un estímulo inflamatorio por estas citocinas in vitro en mamosferas y células en cultivo. Se ha demostrado que los exosomas promueven la migración celular en líneas celulares de cáncer de mama, tanto de fenotipo Luminal A (MCF7) como de Triple negativo (MDA MB 231, metastásico), y que el efecto se ve aumentado en exosomas aislados de las células MDA MB 231, esto sugiere que los exosomas liberados podrían desempeñar un papel activo en la invasión y la metástasis, lo cual además es dependiente del subtipo molecular de cáncer de mama.
Por otro lado, datos no publicados de nuestro grupo demuestran un efecto diferencial de los exosomas derivados de cultivos en monocapa y mamosferas de cáncer de mama en el proceso de angiogénesis in vitro, siendo las microvesículas derivadas de mamosferas las que mostraron un potencial angiogénico incrementado en comparación con los de células en monocapa en la línea celular de CM 4T1 de ratón. La evidencia que asocia los exosomas y al microambiente tumoral con funciones como angiogénesis y metástasis, sumado a todo lo anterior nos llevó a suponer que la estimulación de mamosferas y líneas celulares de cáncer de mama con IL6 e IL-8 tendrá un efecto en la función de sus exosomas en procesos fundamentales para la progresión del cáncer como es la angiogénesis, y que habrá un efecto diferencial en los diferentes subtipos moleculares como el Luminal A y el Triple Negativo (metastásico). Se generaron mamosferas de para la línea MCF7 (fenotipo Luminal A) y para la línea HCC70 (fenotipo Triple Negativo); y se determinó el fenotipo por citometría de flujo FACS para los marcadores de BCSC CD44 y CD24. Se encontró doble positividad de marcadores (CD24+/CD44+) para las mamosferas de ambas líneas. A partir de los sobrenadantes de los cultivos de células adherentes y mamosferas se obtuvieron exosomas por ultracentrifugación y se identificaron por Western blot para la tetraspina de membrana CD81 y la proteína cargo de exosomas TSG 101. Las muestras de exosomas fueron observadas por Microscopia Electrónica de Transmisión y la distribución del tamaño de microvesículas fue determinada por NTA encontrando heterogeneidad de microvesículas. Para determinar el efecto funcional de los exosomas de células y mamosferas estimuladas y no estimuladas con IL-6 e IL-8 se realizaron ensayos de angiogénesis in vitro en células HUVEC. Se observó claramente una mayor inducción de nodos, segmentos y redes de los exosomas derivados de la línea HCC70 (fenotipo Triple Negativo, metastásico) con respecto a los derivados de la línea MCF7 (fenotipo Luminal A). Se encontró un notorio incremento en la inducción de nodos por parte de los exosomas de células MCF7 y HCC70 estimuladas con IL-8. Incluso la inducción con exosomas de células HCC70 estimuladas con IL8 fue significativamente mayor al control positivo (FGFb). Para HCC70 el estímulo con IL-6 en las mamosferas produjo incremento significativo en la formación de nodos y redes, mientras para las células fue el estímulo con IL-8. Para MCF7 únicamente el estímulo con IL-8 en las mamosferas produjo un incremento significativo en la formación de redes con respecto al control.
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