Caracterización bioquímica y espectro de inhibición microbiana de las bacteriocinas producidas por Lactobacillus buchneri y Lactobacillus paracasei Pubblico Deposited
Lactic acid bacteria (LAB) are able to produce a number of metabolites with antimicrobial ability. Bacteriocines are a group of biological compounds produced by these microorganisms that may be applied to extend food shelf-life. These peptides are active against Gram positive bacteria, their inhibition spectra includes several toxic and infectious bacteria such as Listeria monocytogenes and Clostridium botulinum. Due their heat resistance, some bacteriocins can be also applied on foods together with other preservation methods. However, in order to efficiently apply bacteriocins in real food systems, optimization of the preservation process involved is necessary through control at biochemical, microbial and technical levels. The present thesis studied the bacteriocins produced by two LAB (Lactobacillus buchneri and Lactobacillus paracasei), isolated from red meats. Several production, activity and stability characteristics of these bacteriocins were studied. The experiments carried out were focused on biochemical and physiological properties of the bacteriocins and the producing bacteria as preliminary studies for the futher use these compounds in red meat preservation. The first part of the thesis was the study of the bacteriocins¶ inhibition spectra. It was observed that Lactobacillus buchneri and Lactobacillus paracasei bacteriocins inhibited the growth of Listeria monocytogenes NCTC 11994 and L. monocytogenes LMB 92000/48 respectively. Studies were also carried out in order to determine the bacteriocins¶ biochemical characteristics. The bacteriocin produced by Lactobacillus buchneri was resistant to heating at 100°C during 20 min showing circa 15% activity reduction, also observed in the bacteriocin produced by Lactobacillus paracasei when subjected to similar heating conditions. The highest activity for both bacteriocins were observed at pH 3.0 to 4.0. It was concluded that both properties favor the bacteriocin application in high acid foods. The ability to inhibit Listeria monocytogenes growth as well as their heat resistance suggested that the bacteriocins belong to Group II (no-lantibiotics), Class IIa. Even thougth, it is necessary to determinate their aminoacid sequence and molecular weight in order to confirm this classification. The studied bacteriocins kept their antimicrobial activity during storage at 4°C for 10 days, therefore it can be assumed that these compounds can be applied to foods under refrigeration conditions. They were adsorbed by their producing cells in a pH range from 5.5 to 6.5. This property could be used to improve their diffusion, preventing cell adsorption when applied in foods by in situ production. A primary production pattern was observed for both bacteriocins. Production under the experimental conditions was related to microbial growth, favored by a nitrogen atmosphere. With respect to production temperature, 30°C was the optimum for Lactobacilus buchneri and 35°C for Lactobacillus paracasei. It was also observed that 1% Tween 80 increased the recovery rate of both bacteriocins. Althougth the studies at laboratory level cannot fully explain production, activity and stability dynamics for these bacteriocins in food systems preservation, these results can contribute towards a more efficient use of bacteriocins in foods by in situ production as well by the use of the purified compounds.
Las bacterias lácticas producen una serie de metabolitos con actividad antimicrobiana. Las bacteriocinas constituyen uno de los grupos importantes de compuestos biológicos producidos por estos microorganismos, que pueden ser empleadas en la extensión de la vida útil de los alimentos. Estos péptidos son bioactivos contra bacterias Gram positivas y su espectro de inhibición incluye algunas bacterias productoras de toxiinfecciones alimentarias como Listeria monocytogenes y Clostridium botulinum. Además, algunas bacteriocinas, por sus propiedades bioquímicas como la resistencia térmica, pueden ser aplicadas en los alimentos en conjunto con otros tratamientos de conservación. Sin embargo, para que su empleo en sistemas reales sea efectivo, es necesario optimizar el proceso de conservación a través de su control a nivel bioquímico, microbiológico y tecnológico. En esta tesis se abordó el estudio de las bacteriocinas producidas por dos bacterias lácticas (Lactobacillus buchneri y Lactobacillus paracasei) aisladas de carnes rojas. El estudio se enfocó en evaluar aspectos de producción, actividad y estabilidad que pueden determinar su óptima aplicación en la conservación biológica de los alimentos. Se observará que las bacteriocinas de Lactobacillus buchneri y Lactobacillus paracasei inhiben el crecimiento de Listeria monocytogenes NCTC 11994 y Listeria monocytogenes LMB 92000/48, respectivamente. Posteriormente se realizó una serie de estudios sobre las características bioquímicas. La bacteriocina producida por Lactobacillus buchneri presentó resistencia térmica a un tratamiento a 100°C durante 20 minutos, con una pérdida de actividad alrededor del 15%. Resultados similares se obtuvieron para la bacteriocina producida por Lactobacillus paracasei bajo el mismo tratamiento. El pH óptimo de actividad de ambas bacteriocinas se encontró en un intervalo de 3.0-4.0. Ambas propiedades favorecen su posible aplicación en alimentos sometidos a tratamientos térmicos o en alimentos de alta acidez. La propiedad de inhibir el crecimiento de Listeria monocytogenes y su resistencia térmica permiten sugerir que las bacteriocinas estudiadas pertenecen al Grupo II (de los no lantibióticos) de la Clase IIa. Sin embargo es necesario determinar la secuencia de aminoácidos y peso molecular para confirmar esta clasificación. Las bacteriocinas mantuvieron la mayor parte de su actividad antimicrobiana, alrededor del 85%, durante el almacenamiento a 4°C y 10 días, condición que puede favorecer su posible empleo en la conservación de alimentos refrigerados. Las bacteriocinas fueron adsorbidas por sus respectivas células productoras en un intervalo de pH de 5,5-6,5. Esta propiedad favorece su aplicación en alimentos con pH menor a 5.5 debido a que se mejoraría la difusión cuando se emplea en alimentos a través de la producción in situ. La producción de las bacteriocinas bajo las condiciones experimentales evaluadas estuvo asociada al crecimiento microbiano. Se observó que una atmósfera de N2 (180 UA/mL para Lactobacillus buchneri y 120 para Lactobacillus paracasei) favoreció la producción en comparación con una mezcla de N2-CO2 (150 y 100 UA/mL respectivamente) y CO2 (60 y 30 UA/ mL respectivamente). La temperatura óptima de producción para la cepa de Lactobacillus buchneri era de 30°C mientras que para la cepa de Lactobacillus paracasei era de 35°C. También se encontró que el Tween 80 en una concentración al 1% mejora la recuperación de ambas bacteriocinas. Los resultados obtenidos pueden contribuir a orientar hacia una mayor eficiencia el uso de las bacteriocinas en alimentos, tanto por producción in situ o mediante el empleo de bacteriocinas purificadas. as bacterias lácticas (BAL) son capaces de producir una serie de metabolitos con capacidad antimicrobiana. Las bacteriocinas son un grupo de compuestos biológicos producidos por estos microorganismos que pueden aplicarse para prolongar la vida útil de los alimentos. Estos péptidos son activos contra bacterias Gram positivas, su espectro de inhibición incluye varias bacterias tóxicas e infecciosas como Listeria monocytogenes y Clostridium botulinum. Debido a su resistencia al calor, algunas bacteriocinas también pueden aplicarse en alimentos junto con otros métodos de conservación. Sin embargo, para aplicar eficientemente las bacteriocinas en sistemas alimentarios reales, es necesaria la optimización del proceso de conservación involucrado a través del control a niveles bioquímicos, microbianos y técnicos. La presente tesis estudió las bacteriocinas producidas por dos BAL (Lactobacillus buchneri y Lactobacillus paracasei), aisladas de carnes rojas. Se estudiaron varias características de producción, actividad y estabilidad de estas bacteriocinas. Los experimentos realizados se centraron en las propiedades bioquímicas y fisiológicas de las bacteriocinas y las bacterias productoras como estudios preliminares para el uso futuro de estos compuestos en la conservación de carnes rojas. La primera parte de la tesis fue el estudio de los espectros de inhibición de las bacteriocinas. Se observó que las bacteriocinas de Lactobacillus buchneri y Lactobacillus paracasei inhibieron el crecimiento de Listeria monocytogenes NCTC 11994 y L. monocytogenes LMB 92000/48 respectivamente. También se realizaron estudios para determinar las características bioquímicas de las bacteriocinas. La bacteriocina producida por Lactobacillus buchneri fue resistente al calentamiento a 100°C durante 20 min mostrando una reducción de actividad de alrededor del 15%, también observada en la bacteriocina producida por Lactobacillus paracasei cuando se sometió a condiciones de calentamiento similares. La actividad más alta para ambas bacteriocinas se observó a pH 3.0 a 4.0. Se concluyó que ambas propiedades favorecen la aplicación de bacteriocinas en alimentos con alto contenido de acidez. La capacidad de inhibir el crecimiento de Listeria monocytogenes, así como su resistencia al calor, sugieren que las bacteriocinas pertenecen al Grupo II (no-lantibióticos), Clase IIa. Sin embargo, es necesario determinar su secuencia de aminoácidos y peso molecular para confirmar esta clasificación. Las bacteriocinas estudiadas mantuvieron su actividad antimicrobiana durante el almacenamiento a 4°C durante 10 días, por lo que se puede asumir que estos compuestos pueden aplicarse a alimentos en condiciones de refrigeración. Fueron adsorbidas por sus células productoras en un rango de pH de 5,5 a 6,5. Esta propiedad podría utilizarse para mejorar su difusión, evitando la adsorción celular cuando se aplican en alimentos mediante producción in situ. Se observó un patrón de producción primaria para ambas bacteriocinas. La producción en las condiciones experimentales estuvo relacionada con el crecimiento microbiano, favorecido por una atmósfera de nitrógeno. Con respecto a la temperatura de producción, 30°C fue la óptima para Lactobacilus buchneri y 35°C para Lactobacillus paracasei. También se observó que el 1% de Tween 80 aumentó la tasa de recuperación de ambas bacteriocinas. Aunque los estudios a nivel de laboratorio no pueden explicar completamente la dinámica de producción, actividad y estabilidad de estas bacteriocinas en los sistemas de conservación de alimentos, estos resultados pueden contribuir a un uso más eficiente de las bacteriocinas en los alimentos mediante la producción in situ y el uso de compuestos purificados.
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